Cromatografia de troca catiônica: uma técnica para isolar a proteína recombinante alvo do lisado de células de insetos com base na carga superficial líquida

Resumo

Fonte: Agamasu, C. et al. KRAS4b recombinante totalmente processado: isolando e caracterizando a proteína farnesilada e metilada. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de troca catiônica para isolar a proteína recombinante do lisado de proteína de célula de inseto.

Protocolo

1. Purificação de proteínas

1. Prepare os tampões A–H, conforme visto na Tabela 1.

Solução tampão	Agente tampão (todos os 20 mM)	ph	NaCl (mM)	Imidazol (mM)	MgCl2	TCEP
um	HEPES	7.3	300	-	5	1
O	HEPES	7.3	300	35	5	1
O	HEPES	7.3	300	500	5	1
D	Economia de mercado	6.0	200	-	5	1
E	Economia de mercado	6.0	-	-	5	1
O	Economia de mercado	6.0	100	-	5	1
O	Economia de mercado	6.0	1000	-	5	1
H	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Preparar os materiais de purificação (ver Tabela de Materiais): cocktail inibidor de protease sem EDTA ou outros quelantes; coluna de cromatografia de afinidade de metais imobilizados (IMAC); coluna de cromatografia de troca catiónica (CEX); filtro de seringa de 0,45 μm; imidazol 2 M (pH = 7,5); ultracentrífuga capaz de 100.000 x g; centrífuga de bancada de alta velocidade capaz de 4.000 x g; unidades centrífugas de filtro (10 KDa NMWL); espectrofotómetro capaz de ler a 280 nm; His6-tabaco e instrumentação de cromatografia capaz de misturar duas soluções tampão, aplicar soluções a colunas, criar eluições de gradiente a partir de colunas e coletar frações de colunas.
3. Remova o lisado de células de insetos da diálise e centrifugue a 4.000 x g por 10 min para remover qualquer precipitado. A amostra final dialisada e clarificada neste ponto ainda é frequentemente nebulosa, mas pode ser aplicada sem processamento adicional na coluna CEX subsequente.
4. Prepare uma coluna de troca catiônica de 20 mL (consulte a Tabela de Materiais) lavando com três CVs de Buffer G e, em seguida, com três CVs de Buffer F.
   nota: Embora não tenhamos avaliado meticulosamente outras resinas, vários colegas encontraram baixa resolução com resinas diferentes da resina de alto desempenho SP Sepharose.
5. Diluir 20 mL da amostra dialisada até uma concentração final de NaCl de 100 mM adicionando 20 mL de tampão E e aplicar a amostra diluída na coluna de troca catiônica.
6. Continue a carregar a coluna adicionando amostras recém-diluídas preparadas conforme descrito acima ao tubo de carga, pois a diluição anterior está se aproximando do final da carga.
   nota: Diluir toda a amostra de uma só vez para 100 mM de NaCl resultou em perda significativa de proteína-alvo devido à precipitação.
7. Lave a coluna até a linha de base Abs280 com o tampão F. Isso normalmente requer 3 CV. A proteína é eluída da coluna durante um gradiente de 400 mL (20 CV) do tampão F para o tampão G a 65%, coletado em frações de 6 mL (Figura 1B).
8. Continue lavando a coluna por mais 1.5 CV (65% Buffer G) assim que o gradiente for concluído.

Resultados

Figura 1: Géis SDS-PAGE do processo de purificação. (A) Captura de IMAC do lisado. FNTA / B são as bandas escuras migrando a ~ 48 kDa e o His6-MBP-tev-KRAS4b é a banda escura migrando a ~ 67 kDa. M = escada de peso molecular da proteína; T = proteína total; L = lisado clarificado/carga da coluna; F = fluxo de passagem da coluna. As frações são eluídas com um gradiente de concentração crescente de imida...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos Safe-Lock de 1,8 mL, Natural	Eppendorf	22363204
Frascos de amostrador automático de inserção intertravada Cl SS de 11 mm	Thermo Científico	30211SS-1232
Centrífuga 5427R	Eppendor
Acetonitrila, grau HPLC	Fisher Química	A998-1 1L
Coluna de cromatografia de troca catiônica (CEX)	Ciências da Vida da GE Healthcare	29018183	HiPrep SP Sepharose de alto desempenho
Espectrômetro de massa Exactive Plus EMR	Thermo Científico
Frascos Gilson 7x14 mm Tubos	GE Saúde	BR-1002-12
Centrífuga de alta velocidade/bancada	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	Capaz de até 4.000 xg
Protease do vírus His6-Tobacco Etch (TEV)	Addgene	Rolamento 92414	Purificado de acordo com Raran-Kurussi et al. (2017) Remoção de tags de afinidade com TEV Protease. In: Burgess Brown N. (eds) Expressão gênica heteróloga em E.coli. Métodos em Biologia Molecular, vol 1586. Humana Press, Nova York, NY
Coquetel de inibidores de protease sem EDTA ou outros quelantes	Millipore Sigma	Pág. 8849
Acetato de amônio	Sigma-Aldrich	09689-250 ouros
Gás argônio	Gás de ar	ARUP
ácido fórmico	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Use grau de reagente ou superior
Sistema de cromatografia NGC	BioRad	78880002	Sistema de cromatografia NGC QuestTM 100
Conjunto de extrusora de lipídios com suporte	LIPÍDIOS POLARES AVANTI	610023
Nitrogênio líquido	Gás de ar	NI-DEWAR
Unidades de Filtro Centrífugo Ultra-15, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	Membrana PES
Filtros de centrífuga Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL	Ícone	UFC501024
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima - L80K	capaz de 100.000 xg
Rapazes	sigma	C3023