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1. Preparação dos tampões
- Para preparar o tampão de lavagem ELISA, adicione 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) a 1 L de água deionizada (DI). Adicionar 500 μL de polissorbato-20. Ajuste o pH para 7,2 usando HCl ou NaOH.
- Para preparar o tampão de bloqueio, adicione 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl e 10 g de BSA. Adicionar 500 μL de polissorbato-20 a 1 L de água DI. Ajuste o pH para 7,2 usando HCl ou NaOH.
- Para preparar o tampão de eluição (PBS), adicione 8,01 g de NaCl, 2,7 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 a 1 L de água DI. Ajuste o pH para 7,4 usando HCl ou NaOH.
nota: Uma solução 10x deste tampão pode ser feita e diluída com água DI conforme necessário.
2. Preparação da amostra de OMV
- Cultive células de A. actinomycetemcomitans até a fase exponencial tardia (densidade óptica a 600 nm de 0,7). Pulverizar as células centrifugando duas vezes a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,45 μm.
- Concentrar o sobrenadante livre de bactérias com filtros de corte de 50 kDa de peso molecular. Ultracentrifugar a solução concentrada a 105.000 x g a 4 °C durante 30 min.
- Ressuspenda o pellet em PBS e ultracentrífuga novamente (105.000 x g a 4 °C por 30 min.) Ressuspenda o pellet em 2 mL de PBS.
3. Empacotando a coluna S-1000
- Misture o frasco de estoque de meio de filtração de gel com uma haste de agitação de vidro e despeje em um frasco de vidro o volume necessário para encher a coluna, mais aproximadamente 50% de excesso (cerca de 135 mL). Deixe essas contas descansarem até assentarem e, em seguida, decantar o excesso de líquido. Ressuspenda os grânulos no tampão de eluição, de modo que a solução final seja aproximadamente 70% (em volume) de gel, 30% de tampão. Desgaseifique a solução sob vácuo.
- Monte a coluna de vidro verticalmente usando um suporte de anel e encha com tampão de eluição para molhar as paredes da coluna. Drene o tampão até que reste apenas cerca de 1 cm de tampão na coluna.
- Sem criar bolhas, pipete cuidadosamente as contas na coluna, enchendo-a até o topo. Continue a drenar o excesso de tampão durante todo este processo. Certifique-se de não deixar as contas assentarem completamente antes de adicionar contas adicionais ao topo da coluna. A coluna deve ser embalada a uma altura de cerca de 2 cm abaixo do fundo do reservatório da coluna.
4. Carregamento da amostra e recolha de frações
- Desgaseifique o tampão de eluição sob vácuo. Lavar a coluna com dois volumes de coluna (180 ml) de tampão de eluição.
- Permita que o buffer restante entre totalmente na coluna. Assim que o tampão atingir o topo da camada de gel, pipetar cuidadosamente uma amostra de 2 mL contendo OMVs (a uma concentração lipídica de aproximadamente 100 - 200 nmol / L) na superfície das contas, tomando cuidado para não perturbar nenhuma das esferas no topo da coluna. Deixe a amostra entrar totalmente no gel, ou seja, quando nenhum líquido permanecer acima da camada de gel.
- Adicione cuidadosa e lentamente o tampão de eluição no topo da coluna de gel. Não perturbe a camada superior do gel, pois isso causará a diluição da amostra.
- Coloque um único tubo de 50 mL sob a coluna e abra a coluna. Recolha os primeiros 20 ml do eluente. Adicione tampão de eluição adicional ao topo da coluna, com cuidado, conforme necessário para garantir que a coluna nunca esteja seca.
- Coloque uma série de tubos de 1,5 mL sob a coluna. Inicie a coluna e colete uma série de amostras de 1 mL em cada tubo. À medida que as amostras estão sendo coletadas, continue a adicionar tampão de eluição ao topo da coluna, conforme necessário. Repetir até que tenham sido recolhidas 96 frações. Pare a coluna.
nota: As amostras devem ser armazenadas a -20 °C para armazenamento a longo prazo ou a 4 °C para armazenamento a curto prazo até nova análise.
- Para limpar a coluna, passe um volume de coluna (90 mL) de NaOH 0,1 M através da coluna. Passe dois volumes de coluna (180 mL) de tampão de eluição através da coluna.