1. Produzir e caracterizar o anticorpo
- Expresse o anticorpo
- Descongelar um frasco de células em suspensão HEK num balão de 250 ml contendo 50 ml de meio de expressão suplementado com 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina e 250 ng/ml de anfotericina B. Manter as células a 37 °C com 8% de CO2 em incubadoras humidificadas equipadas com um agitador a 125 rpm. Divida as células para 0,3-0,5 x 106 células/mL (a cada 2-3 dias) pelo menos 2 vezes antes da transfecção.
- Quando uma densidade de 2,5 x 106 células / mL for atingida (2-3 dias após a divisão), prepare uma nova solução de 100 mM CypK. Para isso, pesar 64 mg de CypK, adicionar 2,5 mL de hidróxido de sódio 0,1, vórtice, girar para baixo para recuperar todas as partículas não dissolvidas e sonicate.
- Adicione 2,5 mL de CypK (100 mM em NaOH 0,1 M) a 42,5 mL de meio de expressão suplementado com antibióticos. Misture bem, adicione 250 μL de HCl 0,1 M e esterilize usando um filtro de 0,22 μm.
- Diluir 50 μg de plasmídeos pKym1 HC e LC para 2,5 mL com meio sérico reduzido. Em um tubo separado, dilua 135 μL de reagente de transfecção para 2,5 mL com meio sérico reduzido.
- Cinco minutos após a preparação das soluções, misture os plasmídeos e a solução reagente de transfecção e incube por 20 min para permitir a formação de complexos entre o DNA e o reagente de transfecção.
- Enquanto isso, centrifugue 125 milhões de células na densidade alvo por 5 min a 500 x g, ressuspenda com o meio de expressão contendo CypK e adicione a mistura de reagentes de transfecção de DNA. O CypK pode ser comprado ou sintetizado conforme relatado anteriormente.
- Após incubar as células por 20 h, adicione 250 μL de intensificadores de reagentes de transfecção incluídos no kit.
- Colher anticorpos do sobrenadante 6-7 dias após a adição de CypK (nenhuma mudança de meio é necessária durante a expressão).
*Alternativamente, para obter rendimentos mais altos e consistentes, uma linhagem celular estável pode ser gerada conforme descrito em Oller-Salvia et al. 2018. Neste caso, o trastuzumabe (CypK)2 é expresso simplesmente pela adição de CypK 5 mM no meio de expressão.
- Purifique o anticorpo
- Centrifugue as células por 15 min a 3000 x g.
- Filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,45 ou 0,22 μm. Se o filtro ficar ocluído, substitua-o por um novo e continue filtrando. Se isso acontecer após apenas alguns mililitros, centrifugue o sobrenadante por mais 15 minutos a 7000 x g.
- Adicione resina de proteína A (2 mL / 100 mL de sobrenadante) em uma coluna de cromatografia de polipropileno vazia e equilibre a resina com pelo menos 5 volumes de tampão de lavagem de grânulos (0,1 M de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl).
- Divida o sobrenadante em dois tubos cônicos de 50 mL e adicione 5 tampão de lavagem de esferas (fosfato de sódio 0,5 M, NaCl 150 mM) seguido pela resina de proteína A pré-equilibrada. Coloque o tubo cônico em um rolo por 3 h em temperatura ambiente para puxar para baixo o anticorpo no sobrenadante.
- Em alternativa: adicionar o sobrenadante na coluna com, pelo menos, o dobro do volume de resina recomendado e deixar fluir. Certifique-se de que não haja uma quantidade significativa de anticorpos deixados no sobrenadante por SDS-PAGE. Se houver, elui o sobrenadante através da resina mais uma vez.
- Transfira a resina de proteína A com o sobrenadante para uma coluna e deixe o líquido fluir.
- Adicione 25 mL de tampão de lavagem (ou pelo menos 10 volumes de resina) e deixe fluir.
- Eluir o anticorpo com 4 ml de citrato de sódio 0,1 M, pH 3, em 1 ml de tampão fosfato 1 M, NaCl 150 mM.
- Dilua o anticorpo com 10 mL de PBS, concentre a 0,5-1 mL por filtração centrífuga e troque o tampão três vezes com PBS.
- Purificar as amostras por FPLC usando uma coluna de HIC butílico com um fluxo de 0,5 mL / min e um gradiente de 0-100% em 30 min de tampão com baixo teor de sal (50 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 20% de isopropanol) em tampão com alto teor de sal (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 5% de isopropanol). Recolher todas as fracções e monitorizar a eluição a 280 nm. Pequenas quantidades (< 1 mg) podem ser purificadas com HPLC-HIC nas condições descritas no ponto 2.4 para maximizar o rendimento e a pureza.
- Agrupe as frações que contêm anticorpos, dilua-as para pelo menos 4 mL com PBS, concentre-as por filtração centrífuga e troque o tampão três vezes com PBS.
- Quantifique o anticorpo
- Obter uma concentração aproximada medindo a absorvância a 280 nm com um espectrofotómetro de microvolume.
- Se for necessária uma medição precisa, use um kit ELISA para medir IgGs humanos. Para uma estimativa aproximada, use SDS-PAGE com um corante à base de Coomassie da seguinte forma:
- Prepare os padrões diluindo seis vezes o dobro de um padrão de trastuzumabe quantificado por ELISA a 1 mg / mL.
- Ferva os padrões e as amostras a aproximadamente 0,25 mg / mL na redução do tampão de carga.
- Execute-os em um Bis-Tris SDS-PAGE de 4-12% usando o tampão MES-SDS e manche com um corante à base de Coomassie. Por fim, meça a densidade de cor da banda correspondente à cadeia leve ou pesada usando ImageJ e interpole o sinal das amostras na curva padrão.
- Conservar o anticorpo a 4 °C.
2. Conjugar o anticorpo e caracterizar o ADC
- Conjugar o anticorpo com a molécula portadora de tetrazina
- Dilua 10 equivalentes molares de tetrazina-vcMMAE (4 μL, 3,4 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) com 20 μL de acetonitrila e 76 μL de PBS em um pequeno tubo cônico (por exemplo, tubo de PCR).
- Adicione 1 equivalente molar de trastuzumabe (CypK) 2 (100 μL, 2 mg / mL em PBS), misture bem e deixe reagir por 3 h à temperatura ambiente (25 ° C) para formar trastuzumabe (MMAE) 2.
nota: Outras moléculas, como a tetrazina-5-TAMRA, podem ser ligadas ao anticorpo em vez da tetrazina-vcMMAE usando este protocolo.
- Purifique o ADC
- Pré-equilibre uma coluna de rotação de exclusão de tamanho com PBS seguindo as instruções do fabricante.
- Adicione todo o volume da reação na coluna de centrifugação e centrifugue a 1500 x g por 1 min.
- Quantificar o ADC e analisar o conjugado por SDS-PAGE
- Quantificar o ADC conforme descrito no ponto 1.3.2 medindo a densidade de cor da cadeia leve numa SDS-PAGE utilizando o anticorpo não modificado para a curva-padrão.
- A cadeia pesada deve ter se deslocado ligeiramente, mostrando um aumento no peso molecular com a conjugação.
Nota: Se o anticorpo for modificado com um fluoróforo, como no trastuzumabe (TAMRA)2, apenas a banda correspondente à cadeia pesada deve mostrar fluorescência no gel antes da coloração.
- Analise o conjugado por HPLC-HIC
- Equilibre a coluna HPLC-HIC com tampão A 100% (1,5 M (NH4)2SO4, fosfato de sódio 50 mM pH 7,0, isopropanol 5%) por 5 min.
- Misture 15 μL (67 pmol) de uma solução de 1 mg / mL de trastuzumabe (CypK) 2 com 15 μL de 2x tampão A em um frasco para injetáveis. Em seguida, programe uma injeção de 10 μL na HPLC.
- Eluir em um fluxo isocrático de 1 mL / min com 100% de tampão A por 1 min, seguido por um gradiente de 15 min de 100 a 0% do tampão A em B (50 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 20% de isopropanol). Monitorizar a eluição a 280 nm.
- Calcule o DAR integrando o pico correspondente a cada espécie e usando as áreas resultantes na seguinte equação:
DAR = (1x trastuzumabe(MMAE) + 2x trastuzumabe(MMAE)2)
/(trastuzumabe(MMAE)0 + trastuzumabe(MMAE)1 + trastuzumabe(MMAE)2)
O tempo de retenção esperado para trastuzumabe (CypK) 2 é de 7,5-8,0 min, para trastuzumabe (CypK, MMAE) é de 9,1-9,6 min e para trastuzumabe (MMAE) 2 é de 10,5-11,0 min.