Cromatografia de exclusão de tamanho por detecção de fluorescência: uma técnica para identificar a integridade de proteínas de membrana fluorescente após solubilização de detergente

Resumo

Fonte: Bird, L. E., et al. Triagem de expressão baseada em proteína fluorescente verde de proteínas de membrana em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho de detecção de fluorescência para rastrear a estabilidade da proteína de membrana fundida com proteína fluorescente verde (GFP) em Escherichia coli após a solubilização do detergente. Proteínas que exibem um pico simétrico no perfil de exclusão de tamanho com pouca ou nenhuma GFP livre indicam proteínas purificadas com degradação e agregação mínimas, que podem ser posteriormente selecionadas para análise estrutura-função.

Protocolo

1.Solubilização e Análise da Fração de Membrana

1. Descongelar a fracção de membrana (se necessário) e, para cada detergente a utilizar para a solubilização, alíquota de 900 μl da suspensão de membrana para um tubo de microcentrífuga de polialómero de 1,5 ml.
2. Adicione 100 μl de cada detergente recém-preparado (soluções a 10% p/v de DDM, DM, Cymal-6 e LDAO) a uma concentração final de 1% no tubo especificado de 1,5 ml. Para solubilização de proteínas de membrana eucarióticas, o hemisuccinato de colesterol (concentração final de 0,2%) pode ser adicionado aos detergentes.
3. Incubar as misturas a 4 °C durante 1 hora com agitação ligeira.
4. Pelotizar a fração insolúvel do detergente com uma ultracentrífuga de bancada, garantindo que os tubos estejam pelo menos meio cheios, a 150.000 g a 4 °C por 45 min e retenham o sobrenadante.
   nota: A eficácia da solubilização do detergente pode ser estimada usando um leitor de placas fluorescentes, medindo a fluorescência GFP das membranas solubilizadas com a fração insolúvel do detergente ressuspensa no mesmo volume de PBS.
5. Analise a monodispersidade dos diferentes detergentes: complexos de proteínas de membrana usando cromatografia de exclusão de tamanho detectada por fluorescência (FSEC).
6. Para análise FSEC, equilibre uma coluna de exclusão de tamanho com uma ampla faixa de fracionamento, por exemplo, 5.000 a 5.000.000 de peso molecular, com tampão de corrida (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) a uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min. Use este tampão para todas as amostras, ou seja, ele não é alterado para cada detergente testado.
7. Injetar 100 μl de membranas solubilizadas na coluna a um caudal de 0,3 ml/min. Monitorizar o perfil de eluição utilizando óptica de fluorescência (excitação a 488 nm e emissão a 512 nm). Se um monitor de fluorescência em linha não estiver disponível, colete as frações e leia a fluorescência em um leitor de placas.
8. Importe dados de volume de eluição e intensidade de fluorescência para um programa de planilha para exibição gráfica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hemisuccinato de colesterol	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-ciclohexil-1-hexil-βD-maltosídeo)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecil β-maltosídeo)	Geração	D97002
DM (n-decil β-maltosídeo)	Geração	D99003
LDAO (N,N-Dimetil-ndodecilamina N-óxido)	Geração	D71111
Padrão de proteína fluorescente BenchMark	Tecnologias da Vida	LC5928
Ultracentrífuga Optima L-100 com rotor de 45 Ti	Beckman Coulter	393253
Ultracentrífuga Optima Max-XP com rotor TLA-55	Beckman Coulter	393315
Proeminência UFLC com detector de fluorescência RF-20A	Shimadzu
Coluna de exclusão de tamanho Sepharose 6 10/300 GL	GE Saúde	17-5172-01