Cromatografia de afinidade baseada em DFE: uma técnica para purificação de anticorpos monoclonais 2F5 de uma amostra bruta usando condições de eluição baseadas em alta força iônica

Abstract

Fonte: Knödler, M. et al., Ativada Ligação-Acinzentada para o Rápido Desenvolvimento de Resinas de Cromatografia de Afinidade - Captura de Anticorpos como Estudo de Caso. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve uma técnica de cromatografia de afinidade para purificar anticorpos monoclonais 2F5 usando os ligantes DsRed-2F5-Epitope ou DFE. Os anticorpos monoclonais 2F5 purificados são medicamentos essenciais na imunoterapia.

Protocol

1. Testando a purificação de mAbs de extratos de plantas clarificadas

1. Preparar 100 ml de extracto vegetal clarificado contendo 2F55 ou o sobrenadante do sistema de expressão celular preferido, contendo também 2F5.
2. Prepare tampão de equilíbrio (fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,4), tampão de eluição de baixo pH (citrato 0,05 M, cloreto de sódio 0,05 M, pH 4,0–3,25) e tampão de eluição de alta força iônica (cloreto de magnésio 1,0–4,0 M, HEPES 0,1 M, pH 8,0)
3. Lave o sistema de cromatografia com os tampões. Monte uma coluna de afinidade DFE (consulte o texto principal do protocolo) no sistema de cromatografia e equilibre com 5 CV de tampão de equilíbrio a uma taxa de fluxo de 1,0 mL ^min-1. Monitore a absorbância UV a 280 nm.
   nota: Carregar extrato de planta ou sobrenadante de cultura de células na coluna pode causar um aumento na contrapressão. Defina um alerta de alta pressão em 0.2 MPa para evitar danos ao sistema de cromatografia ou coluna DFE.
4. Carregue 80 mL do extrato vegetal clarificado ou sobrenadante (etapa 1.1) na coluna a uma taxa de fluxo de 0,5 mL min-1 para garantir um tempo de contato de 2 min. Colete as amostras de fluxo em frações de 2 mL para reconstrução da curva de ruptura. Armazenar as amostras de escoamento a 4 °C se a análise imediata da amostra não for possível.
5. Lave a coluna com 6 CV de tampão de equilíbrio. Colete uma amostra da lavagem no início, meio e final desta etapa.
6. Eluir mAb 2F5 com 5 CV de tampão de eluição de baixo pH ou tampão de eluição de alta força iônica (HEPES 0,1 M, cloreto de magnésio 1,25 M, pH 8,0). Colete a fração DFE quando o sinal UV 280 nm aumentar para 5 mAU acima da linha de base.
   1. Otimize o tampão de eluição para cada par epítopo-anticorpo. Para 2F5, o cloreto de magnésio 1,25 M alcançou um equilíbrio ideal entre a recuperação do produto e a estabilidade do ligante.
      nota: A solução de cloreto de magnésio é propensa à precipitação. Portanto, dissolva o cloreto de magnésio em ~ 700 mL de água. Dissolva separadamente o HEPES em 100 mL de água e ajuste o pH para 8,0. Adicione a solução de cloreto de magnésio dissolvido à solução HEPES e adicione água até um volume final de 1,0 L. Não ajuste o pH após dissolver o cloreto de magnésio, pois isso causará precipitação.
7. Analise todas as amostras coletadas durante as etapas 1.4–1.6 usando o método de Bradford, eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de lítio (LDSPAGE) e espectroscopia de ressonância plasmônica de superfície (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Padrão
HiTrap Sepharose HP ativada por NHS, 1 mL	GE Cuidados com a Saúde	17-0716-01	Colunas de cromatografia
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente de buffer
Cloreto de magnésio	Carl Roth GmbH	KK36.2	Componente de buffer
PH 3110	WTW	2AA110	Medidor de pH
Sephadex G-25 fino, dextrano reticulado	GE Cuidados com a Saúde	17003301	Resina para cromatografia
cloreto de sódio	Carl Roth GmbH	Pág. 029.2	Componente de buffer
Citrato de sódio	Carl Roth GmbH	HN13.2	Componente de buffer