Ensaio de atividade enzimática baseado em cromatografia em camada fina: uma técnica para determinar a atividade da pirofosfoquinase in vitro usando cromatografia em camada fina

Resumo

Fonte: Pokhrel, A., et al. Um ensaio de purificação e atividade in vitro para uma (p)ppGpp sintetase de Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um ensaio enzimático baseado em cromatografia em camada fina para determinar a atividade da pirofosfoquinase usando nucleotídeos radiomarcados. O método fornece informações sobre a síntese de nucleotídeos e reações de fosfotransferência.

Protocolo

1. Ensaio de atividade proteica por cromatografia em camada delgada

1. Preparar a placa de cromatografia em camada delgada (TLC).
   1. Prepare placas de polietilenoimina (PEI)-celulose lavando em água deionizada. Coloque as placas em uma câmara de vidro com água bidestilada a uma profundidade de ~0.5 cm.
   2. Deixe a água migrar para o topo da placa.
      NOTA: A lavagem das placas não é estritamente necessária, pois as placas podem ser usadas sem ela, mas a lavagem aumenta a clareza das imagens resultantes. A lavagem das placas em duas direções perpendiculares garante ainda mais que quaisquer contaminantes presentes na resina sejam isolados em um canto da placa (Figura 1).
   3. Retire as placas da câmara de vidro e deixe secar em uma grelha de bancada durante a noite (12–18 h).
   4. Marque as placas secas a 2,0 cm de uma borda com um lápis macio para indicar onde as amostras serão aplicadas para TLC. Para amostras de 2 μL, aplique amostras com pelo menos 1,0 cm de distância (Figura 1).
      NOTA: Isso permite uma separação clara entre pontos adjacentes, o que é crítico para a quantificação do sinal. Desde que a resina de celulose não seja arranhada, pequenas marcas de lápis na superfície não interferem na migração do solvente.
   5. Ao planejar experimentos, sempre deixe um ponto em cada placa sem uso.
      NOTA: Isso fornecerá uma pista em branco para quantificação da amostra (Figura 1). Uma placa TLC de 20 cm terá espaço para 19 vagas.
2. Ensaio de atividade enzimática
   1. Prepare uma mistura tampão 5x contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM de acetato de amônio, 10 mM de KCl, 1 mM de DTT e 0,6 mM de ATP (trifosfato de adenosina).
      NOTA: Esta mistura pode ser preparada em grandes quantidades e congelada em alíquotas de 10 μL para uso posterior. Não sujeite a mistura a vários ciclos de congelamento e descongelamento.
   2. Prepare reações individuais contendo 3 μM RSH (enzimas homólogas Rel / Spo), 1x mistura de tampão, 0,6 mM GDP (difosfato de guanosina), 1,2 mM MgCl₂. Adicione 1,0 μCi de ^γ-32P-ATP (ATP radiomarcado) por 10 μL de reação e use água livre de nuclease para levar a reação até o volume desejado. Adicione o RSH após os outros componentes terem sido misturados, pois a adição de RSH à mistura contendo nucleotídeos inicia o ensaio de atividade enzimática.
      NOTA: O volume final da reação dependerá do número de pontos de tempo amostrados. Para amostrar 2 μL/ponto de tempo, monte 10 μL de mistura de reação para cada 4 pontos de tempo.
   3. Para controlar a hidrólise do ATP da atividade contaminante da nuclease, monte uma reação de 10 μL sem proteína e incube-a em paralelo. Identificar amostras de 2 μL em t = 0 e no final do experimento para garantir que o ATP não foi hidrolisado na ausência de proteína.
   4. Imediatamente após a adição de RSH, remova 2 μL e coloque-o na placa de PEI-celulose rotulada como a amostra t = 0 min.
   5. Incubar a reação a 37 °C, removendo alíquotas de 2 μL nos pontos de tempo desejados.
      NOTA: A atividade enzimática cessará quando a amostra for adsorvida na placa de celulose. Aguarde de 10 a 30 minutos após a última mancha ser adicionada à placa antes do desenvolvimento para garantir a adsorção completa e a secagem da amostra.
3. Cromatografia em camada delgada
   1. Encher a câmara de cromatografia com 1,5 M 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,64) até uma profundidade de 0,5 cm.
      NOTA: O volume necessário dependerá das dimensões do tanque de cromatografia. Qualquer recipiente de vidro com um fundo nivelado que seja suficientemente largo para permitir a inserção da placa de TLC sem dobrar pode ser utilizado como tanque de revelação com a adição de uma tampa. A placa TLC pode ser cortada em tiras mais estreitas com uma lâmina de barbear limpa para permitir o desenvolvimento em um copo de vidro coberto com filme plástico.
   2. Mergulhe a borda inferior da placa em solvente. Deixe o solvente migrar para o topo da placa (~90 min).
      NOTA: Embora a migração do solvente seja interrompida na parte superior da placa e as amostras não sejam perdidas ou escorridas juntas durante uma imersão mais longa, as placas não devem ser deixadas no solvente durante a noite. Imersões por mais de 4 h podem fazer com que a resina se solte do suporte da placa e resulte em perda de sinal.
   3. Retire a placa do tanque de cromatografia e coloque-a em um escorredor de bancada.
   4. Deixe a placa secar ao ar durante a noite.
      NOTA: A secagem pode ser acelerada usando um secador de cabelo. A secura pode ser avaliada pela cor da resina, que escurece quando molhada e retorna à cor de uma placa não utilizada quando completamente seca.
   5. Depois que a placa estiver seca, envolva-a em filme plástico para evitar a transferência de material radioativo para o de imagem e analise por autorradiografia (Figura 2).
4. análise de dados
   1. Expor a placa de PEI-celulose contendo reações separadas a um de fósforo por 4 h à temperatura ambiente.
      NOTA: Esta é uma exposição suficiente para produzir uma imagem muito nítida usando as concentrações indicadas de ^γ-32P-ATP fresco. Se forem utilizadas quantidades menores de substrato radiomarcado, o tempo de exposição pode ser aumentado para 12-16 h.
   2. Visualize o em um fosforógrafo.
   3. Usando um software de imagem com uma interface gráfica do usuário, desenhe Regiões de Interesse (ROIs) selecionando Desenhar Retângulo e usando o mouse para desenhar ROIs retangulares em torno de uma pista inteira e os pontos ATP e ppGpp (tetrafosfato de guanosina) contidos nessa pista (Figura 2).
   4. Use os comandos Selecionar, Copiar e Colar (ou comandos correspondentes com base no software de imagem que está sendo usado) para desenhar ROIs idênticas nas outras pistas para garantir que as ROIs estejam medindo o sinal em áreas idênticas em cada pista. Inclua ROIs de uma pista não utilizada, para serem usados como espaços em branco.
   5. Usando a ferramenta Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI | Adicione comandos do software de imagem, selecione todas as ROIs desenhadas na placa de celulose PEI.
   6. Usando a ferramenta Analisar | Definir Medidas | Meça comandos, quantifique a intensidade do sinal dentro de cada ROI e exporte as medições como uma planilha (Figura 2). Subtraia os valores de ROI em branco dos sinais experimentais.
      
   7. Calcule qual porcentagem do sinal em branco dentro de cada pista é atribuível a ATP e ppGpp usando as fórmulas.
      NOTA: Os ROIs podem ser desenhados e quantificados usando software comercial compatível com o fosforimager ou o software ImageJ (National Institutes of Health) disponível gratuitamente.

Resultados

Figura 1: Preparação das placas de TLC. (A) As placas são lavadas em uma dimensão, colocando a borda inferior na água (azul). Os contaminantes (amarelos) migram para o topo da placa com o solvente. (B) Depois que uma placa é completamente seca, ela é lavada em uma segunda dimensão, girando-a 90 ° em relação à primeira lavagem e novamente permitindo que a água migre para o topo da placa. (C) Após a lava...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tanque de desenvolvimento de cromatógrafo de camada fina (TLC)	Empresa de sopro de vidro geral	80-3
Placas de polietilenonimina (PEI)-celulose (20 cm x 20 cm, 100 μm de espessura) com suporte de poliéster	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml de chumbo, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenosina 5'-trifosfato (ATP) 100 mM	Bio Basic Canadá	AB0311
Sal dissódico de guanosina-5'-difosfato (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Tela de fósforo de armazenamento	Ciências da Vida da GE Healthcare	BAS-IP TR 2040 E Tela de trítio
Storm 860 termovisor de fósforo	Ciências da Vida da GE Healthcare	-