1. Cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC) para semiquantificar a quantidade de vários lipídios, incluindo colesterol, fosfolipídios e esfingomielina
- Prepare as quatro soluções de execução e soluções de coloração a seguir.
- Solução 1: Misture acetato de etila (26,6%), 1-propanol (26,6%), clorofórmio (26,6%), metanol (26,6%) e cloreto de potássio (9,6%). Prepare o KCl dissolvendo 0,25 g de KCl em 100 mL de água com qualidade de HPLC.
- Solução 2: Misture n-hexano (73%), éter dietílico (23%) e ácido cítrico (2%).
- Solução 3: 100% n-hexano.
- Prepare a solução de coloração misturando água destilada (90 mL) com 7,5 g de sulfato de cobre e, em seguida, adicione 10 mL de ácido fosfórico.
- Encher até 5 mm de cada solução numa câmara de vidro separada. Adicione qualquer tipo de papel de filtro para aumentar a velocidade de funcionamento em cada câmara.
- Pré-incubar uma placa de vidro HPTLC sílica gel 60 de 20 x 10 cm na primeira solução em funcionamento até que a solução em curso atinja o topo da placa. Em seguida, seque por 10 min a 110 °C.
nota: Essas placas podem ser armazenadas para uso futuro em papel alumínio e secas por 10 min a 110 °C antes do uso.
- Dissolver um sedimento lipídico obtido a partir de neutrófilos derivados do sangue periférico humano em 200 μL de solução de clorofórmio/metanol (1:1) e incubar durante 15 min a 37 °C para dissolver.
- Use uma régua e um lápis macio para marcar os pontos de carregamento para o número desejado de amostras, além de pelo menos um padrão. Marque a distância de corrida em aproximadamente 4 cm e 6 cm para a primeira e segunda solução de corrida, respectivamente.
- Para carregar as amostras, lave a seringa de 10 μL 3 vezes em clorofórmio/metanol (1:1) antes de carregar cada nova amostra. Carregue 10 μL de cada amostra gota a gota, tentando concentrar a amostra na menor área possível. As amostras devem ser carregadas pelo menos em duplicado.
- Colocar a placa verticalmente na primeira câmara com a solução corrente 1 (passo 1.1.1). Certifique-se de que a placa esteja paralela à parede da câmara de vidro para obter uma velocidade de migração uniforme.
- Quando a linha de solvente atingir a primeira marca, remova a placa, seque-a e coloque-a na segunda solução. Repita etapas semelhantes para a segunda e para a terceira soluções em execução; deixar a placa na solução até que a frente do solvente atinja o topo da placa, depois retirá-la e secá-la à temperatura dos ovos durante 1 min.
- Coloque o prato na solução de sulfato de cobre por 7 s. Remova o prato, seque-o bem e leve ao forno por 7 min a 170 ° C. Espere o prato esfriar.
- Usando um software de análise de cromatografia e gel em camada fina, bem como um software de processamento de imagem, escaneie e analise para identificar as bandas resolvidas de lipídios.
