Eletroforese em gel de poliacrilamida: uma técnica analítica para detectar sulfatos de heparano de diferentes comprimentos de cadeia isolados de tecido pulmonar de camundongo

Resumo

Fonte: LaRiviere, W. B. et al., Detecção de glicosaminoglicanos por eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração de prata. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o procedimento de separação de sulfatos de heparano isolados de tecido pulmonar de camundongo usando eletroforese em gel de poliacrilamida.

Protocolo

1. Eletroforese em gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos isolados e purificados

1. Prepare as soluções necessárias para a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com antecedência (Tabela 1).
   nota: Selecione a porcentagem de acrilamida da solução de gel de resolução, dependendo do tamanho dos glicosaminoglicanos que se espera que estejam na amostra. 15% é recomendado para resolver fragmentos maiores (mais de 30 subunidades de dissacarídeos de comprimento); 22% para fragmentos menores (<20 subunidades de dissacarídeos de comprimento).
2. Coloque o vazio no tanque PAGE. Moldar o gel de resolução da seguinte forma: Em tubo de 15 mL, misture 10 mL de solução de gel de resolução, 60 μL de persulfato de amônio a 10% (deve ser preparado na hora) e 10 μL de TEMED (adicione TEMED por último). Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use a pipeta para adicionar rapidamente a solução de 10 mL acima ao. Cubra com 2 mL de água deionizada e filtrada e deixe o gel de resolução polimerizar por 30 min.
   nota: O protocolo PAGE a seguir foi otimizado para um sistema PAGE vertical usando de fundição de 13,3 x 8,7 cm (largura x comprimento) e 1,0 mm de espessura com um volume total de aproximadamente 12 mL. Outros sistemas de podem ser usados, mas podem exigir otimização pelo usuário final.
3. Depois que o gel de resolução estiver totalmente polimerizado, descarte a água sobreposta e molde o gel de empilhamento da seguinte forma: em um tubo de 15 mL, misture 3 mL da solução de gel de empilhamento, 90 μL de persulfato de amônio a 10% (deve ser preparado na hora), 3 μL de TEMED (adicione TEMED por último).
4. Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use uma pipeta para adicionar rapidamente a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução solidificado; Encha o até a borda. Insira totalmente o pente incluído na configuração. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por 30 min.
5. Depois que o gel polimerizar, certifique-se de que a tira de fita seja removida da parte inferior do e coloque o de volta no conjunto do tanque PAGE.
6. Encha as câmaras superior e inferior com tampão da câmara superior e inferior, respectivamente.
7. Dissolver as amostras secas do passo 1.11.4 no volume mínimo necessário de água desionizada e filtrada (no máximo, 50% do volume dos alvéolos no gel PAGE). Misture 1:1 com o buffer de carregamento da amostra. Carregue as amostras e as "escadas" de oligossacarídeos HS (ver Tabela 1) no gel.
8. Pré-execute o gel por 5 min a 100 V. Em seguida, execute o gel a 200 V por 20-25 min (para um gel de resolução de poliacrilamida a 15%), 40-50 min (para um gel de resolução de poliacrilamida a 18%), 90-100 min (para gel de resolução de poliacrilamida a 22%).
   nota: Pode ser necessária alguma otimização do tempo de execução de 200 V. O vermelho de fenol migra à frente dos oligossacarídeos de heparina que têm 2 subunidades poliméricas de comprimento (ou seja, grau de polimerização 2 ou dp2); O azul de bromofenol migra antes do DP10-DP14. Os melhores resultados são obtidos quando a voltagem é aplicada de forma que a faixa vermelha de fenol migre quase, mas não exatamente, para o fundo do gel. Ajuste o tempo de execução de acordo.

Resultados

Tabela 1: Soluções necessárias para eletroforese em gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos purificados. Todas as soluções devem ser filtradas (0,22 μm) antes do uso.

NOTA: Todas as soluções devem ser filtradas (0.22μm) antes do uso.
solução	receita	composição

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Persulfato de amônio (sólido)	ThermoFisher Scientific	BP179-25	Grau de eletroforese
Sistema de purificação de água Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Qualquer sistema de deionização/purificação de água é um substituto aceitável
Ácido bórico (sólido)	ThermoFisher Scientific	Rolamento A73-500	Grau de biologia molecular
Azul de bromfenol (sólido)	ThermoFisher Scientific	B392-5
vazio Criterion para PAGE (1,0 mm de espessura, 12+2 poços)	Bio-Rad	3459901	Qualquer sistema de de fundição PAGE de 1,0 mm de espessura será suficiente
Critério PÁGINA Sistema celular (célula e fonte de alimentação)	Bio-Rad	1656019	Qualquer sistema PAGE de gel vertical comparável funcionará)
Sal dissódico EDTA (sólido)	ThermoFisher Scientific	02-002-786	Grau de biologia molecular
Glicina (sólida)	ThermoFisher Scientific	G48-500	Grau de eletroforese
Ácido clorídrico (líquido)	ThermoFisher Scientific	A466-250
N,N'-metileno-bis-acrilamida (sólido)	ThermoFisher Scientific	BP171-25	Grau de eletroforese
Vermelho de fenol (sólido)	ThermoFisher Scientific	Pág. 74-10	Ácido livre
Sacarose (sólida)	ThermoFisher Scientific	BP220-1	Grau de biologia molecular
TEMED (N,N,N',N'-tremetilenodiamina)	ThermoFisher Scientific	BP150-20	Grau de eletroforese
Base Tris (sólida)	ThermoFisher Scientific	BP152-500	Grau de biologia molecular
Unidade de filtro a vácuo, uso único, PES de poros de 0,22 uM, volume de 500 mL	ThermoFisher Scientific	Rolamento 569-0020	Volumes alternativos e materiais filtrantes aceitáveis
Acrilamida (sólida)	ThermoFisher Scientific	BP170-100	Grau de eletroforese
Decasaccarídeo derivado da heparina (dp10)	Galeno científico	HO10
Hexassacarídeo derivado da heparina (dp6)	Galeno científico	HO06
Oligossacarídeo derivado da heparina (dp20)	Galeno científico	HO20