Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio para análise de proteínas: uma técnica para separar e visualizar proteínas com base no peso molecular

Neste artigo

Resumo

Fonte: Sultana, S. et al. Extração e Visualização de Agregados de Proteínas após Tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra uma técnica de separação desnaturante baseada em poliacrilamida para proteínas. Essa técnica auxilia na identificação preliminar de proteínas com base em seus pesos moleculares.

Protocolo

1. Separação e visualização de agregados proteicos extraídos usando SDS-PAGE

Prepare um gel de poliacrilamida SDS a 12%
1. Para dois géis separadores, pipete 5,1 mL de água bidestilada (ddH₂O), 3,75 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL de SDS a 20% (p/v), 6 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida a 30% (29:1), 75 mL de persulfato de amônio a 10% p/v e 10 mL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) em um tubo de centrífuga de 15 mL e misture suavemente sem introduzir bolhas de ar. Despeje o gel usando uma pipeta de 1 mL dentro das placas de vidro, deixando os 2 cm superiores livres da mistura. Adicione etanol 70% na parte superior do gel de separação e permita uma interface uniforme entre as duas camadas.
2. Após a polimerização do gel separador, prepare o gel de empilhamento pipetando 1,535 mL de ddH₂O, 625 mL de Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mL de SDS a 20% (p / v), 335 mL de solução de acrilamida / bisacrilamida a 30% (29: 1), 12,5 mL de persulfato de amônio a 10% p / v e 2,5 mL de TEMED. Remover o etanol dos géis de separação e adicionar a solução de gel de empilhamento. Insira um pente com o número desejado de bolsos sem introduzir bolhas de ar. Deixe a polimerização por 20-30 min.
Carregue 4 μL de cada amostra e escada de proteína em poços separados e execute o(s) gel(is) em tampão de tris-glicina (Tabela 1) a 144 V por 45 min em temperatura ambiente.
nota: Pare o gel quando a banda de bromofenol estiver prestes a migrar para fora do gel.
Manchar o(s) gel(is) em uma solução de Fairbanks A pré-aquecida (Tabela 1) por 30 min em um balancim.
Descolora o (s) gel (s) em uma solução Fairbanks D pré-aquecida (Tabela 1) até o fundo desejado (por exemplo, durante a noite) em um balancim.

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Resultados

Soluções	Receitas
Buffer A	10 mM de fosfato de potássio (pH 6,5), 1 mM de EDTA
Buffer B	Tampão A contendo 2% de Nonidet P-40. Pode ser armazenado em temperatura ambiente para uso posterior.
Fairbanks A (solução de coloração)	25% isopropanol, 10% ácido acético glacial, 1,4 ...