Eletroforese em gel de poliacrilamida de ureia desnaturante para análise de RNA: uma técnica para separar oligonucleotídeos de RNA fosforilados marcados com fluorescência de seus equivalentes não fosforilados

Resumo

Fonte: Pillon, M. C., et al., Ensaio não radioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos uma eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante para a separação de espécies de RNA fosforiladas de suas contrapartes não fosforiladas. As espécies de RNA são marcadas com fluorescência para detecção a laser no gel.

Protocolo

1. Eletroforese em gel

1. Prepare solução de gel de acrilamida a 15%/8 M ureia.
   cuidado: A acrilamida deve ser manuseada com cuidado, pois é uma neurotoxina. Sempre use luvas, jaleco e óculos de proteção ao manuseá-lo.
   1. Em um béquer de vidro de 150 mL, combine 22,5 mL de solução pré-misturada de acrilamida a 40% / bis-acrilamida 29: 1, 6 mL de TBE 10x, 28,8 g de uréia e água livre de RNase para um volume total de 59 mL. Mexa suavemente a solução.
      nota: Dependendo do comprimento do substrato de RNA, alterar a porcentagem de poliacrilamida pode melhorar a resolução entre o RNA não fosforilado e fosforilado.
   2. Para dissolver a ureia, aqueça a solução no micro-ondas por 20 s, mexa o líquido e coloque imediatamente a solução de volta no micro-ondas por mais 20 s. Mexa suavemente a solução até que a uréia se dissolva completamente.
   3. Arrefecer lentamente a solução colocando o copo de vidro num banho-maria pouco profundo com água fria. Certifique-se de que o nível de água fria ao redor do copo de vidro esteja acima do nível de solução dentro do copo de vidro. Isso promoverá uma transferência de calor eficiente. Aguarde 5 min.
      nota: Não continue com este protocolo se o copo de vidro estiver quente; a água deve estar abaixo de 25 °C. Se ainda estiver quente após 5 min, substitua a água do banho-maria por água fria e espere mais 5 min.
   4. Filtrar e desgaseificar a solução utilizando uma unidade de filtragem descartável de 0,22 μm para remover partículas e bolhas de ar microscópicas.
2. Despeje o gel desnaturante
   1. Use sabão e água morna para limpar uma placa de vidro curta e longa projetada para géis com dimensões totais de 31,0 cm x 38,5 cm. Pulverize cada placa de vidro com etanol a 95% e limpe o vidro para remover qualquer umidade.
      nota: Uma das duas placas pode ser siliconizada para evitar danos ao gel ao separar o sanduíche da placa de vidro. No entanto, esta etapa não é necessária porque este protocolo é projetado para visualizar o RNA sem separar as placas de vidro.
   2. Coloque a placa de vidro longa horizontalmente em cima de uma caixa de forma que ela fique elevada da bancada.
      cuidado: A acrilamida é tóxica, portanto, a estação de vazamento de gel deve ser coberta com papel de bancada que possa absorver qualquer líquido derramado e ser imediatamente colocada em um saco de lixo após a conclusão do procedimento.
   3. Coloque um espaçador limpo de 0.4 mm ao longo das bordas longas da placa de vidro longa.
   4. Coloque a placa de vidro curta em cima da placa longa e certifique-se de que as bordas da placa curta, da placa longa e dos espaçadores estejam alinhadas. Prenda cada lado usando três grampos de metal uniformemente espaçados.
   5. Adicione 24 μL de TEMED à solução de acrilamida a 15% / ureia 8 M preparada na etapa 3.1 e misture a solução.
   6. Adicione 600 μL de APS a 10% (p / v) à solução na etapa 1.2.5 e misture suavemente a solução.
   7. Despeje imediatamente a solução entre as placas de vidro.
      nota: Para evitar bolhas, bata no copo enquanto a solução é derramada.
   8. Com cuidado, adicione um pente limpo de 0,4 mm e 32 poços no topo do sanduíche de prato de vidro.
   9. Aguarde um mínimo de 30 minutos para a acrilamida polimerizar.
3. Execute o gel desnaturante
   1. Defina o bloco de calor para 75 °C.
   2. Remova o metal clamps que prendem o sanduíche de placa de vidro juntos e lave e seque bem o sanduíche de placa de vidro.
   3. Coloque o sanduíche de placa de vidro no aparelho de gel com a placa curta voltada para dentro.
   4. Prepare o tampão de corrida 0,5x TBE combinando 100 mL de 10x TBE com 1,9 L de água livre de RNase. Adicione 600 mL do tampão de corrida às câmaras superior e inferior do aparelho de gel.
   5. Remova suavemente o pente e enxágue bem os poços com uma seringa. NOTA: Esta etapa é crítica para remover a ureia dos poços.
   6. Pré-execute o gel por 30 min a 50 W. A tensão é de aproximadamente 2.000 V. CUIDADO: Este aparelho de gel opera em alta potência e os usuários devem ter precaução.
   7. Enxágue bem os poços com uma seringa.
      nota: Esta etapa é crítica para o carregamento uniforme da amostra nos poços.
   8. Gire as reações extintas. Em seguida, incubar os tubos a 75 °C durante 3 min. Repita o giro do pulso.
   9. Carregue imediatamente 10 μL de amostra por poço e execute o gel por 3 h a 50 W.
      nota: O RNA marcado com fluorescência é sensível à luz; Portanto, cubra o aparelho de gel com papel alumínio.
4. Imagem do gel desnaturante.
   1. Desligue a fonte de alimentação e drene a câmara superior do aparelho de gel.
   2. Lave e seque o lado externo do sanduíche de placa de vidro com água e sabão. Cubra o sanduíche de placa de vidro com papel alumínio durante o transporte do gel.
   3. Monte o sanduíche de placa de vidro no palco de um scanner a laser capaz de detecção de fluorescência quantitativa e sensível.
      nota: Este gel é extremamente fino para resolução máxima. Por esse motivo, este protocolo foi projetado para evitar as dificuldades de remover o gel do sanduíche da placa de vidro, visualizando diretamente o RNA marcado com fluorescência através das placas de vidro. O uso de placas de vidro de baixa fluorescência disponíveis comercialmente aumentará o sinal capturado, melhorando a relação sinal-ruído.
   4. Defina os comprimentos de onda de excitação e emissão do scanner a laser para o fluoróforo desejado.
      nota: Os comprimentos de onda ideais de excitação e emissão podem diferir para fluoróforos específicos. Para o fluoróforo FAM, os comprimentos de onda de excitação e emissão são 495 nm e 535 nm, respectivamente.
   5. Defina a área a ser visualizada no estágio do scanner a laser e crie a imagem do gel de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Exemplo de análise de gel desnaturante de RNA fosforilado. Ensaio de RNA quinase in vitro de Las1-Grc3 (110 nM) incubado com RNA SC-ITS2 de 500 nM. X marca a reação de controle sem Las1-Grc3 e o triângulo preto representa a titulação de ATP de 0-10 mM. O RNA C2 é o resultado ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pente de 0,4 mm com 34 poços	BioRad	1653848
Espaçador de 0,4 mm	BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8,0	KD Médico	RGF-3130
1M Cloreto de Magnésio	KD Médico	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Médico	RGF-3360
Solução de 40% de acrilamida/bis 29:1	BioRad	1610146
5M Cloreto de Sódio	KD Médico	RGF-3720
persulfato de amônio (APS)	BioRad	161-0700
ATP	sigma	A2383-1G
ácido bórico	sigma	B0394
sal de sódio azul de bromofenol	sigma	B5525-5G
Placas de vidro	Thomas Científico	1188K51
Sequenciador Hoefer SQ3	Hoefer	N/A
Image J Software	N/A	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucleotídeos de RNA marcados	IDT	Pedido personalizado
Fonte de alimentação Pharmacia EPS 3500	Farmacêutica	N/A
Filtro Steriflip 0. 22 um	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	161-0800
base tris	sigma	TRIS-RO
Gerador de imagens em gel Typhoon FLA 9500	GE Saúde	N/A
Água DEPC ultra pura	Invitrogen	750023
Glicerol Ultra Puro	Invitrogen	19E1056865
ureia	Fisher Química	U15-500