Eletroforese em gel de agarose semi-desnaturante bidimensional: uma técnica para separar fibras amilóides polimórficas com base na heterogeneidade de tamanho

Resumo

Fonte: Hanna-Addams, S., et al. Uso de eletroforese bidimensional em gel de agarose em detergente semidesnaturante para confirmar a heterogeneidade de tamanho de fibras amilóides ou semelhantes a amilóides. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a separação bidimensional semi-desnaturante de fibras amilóides em gel de agarose em gel de agarose. A técnica separa os agregados amilóides polimórficos com base em seu tamanho heterogêneo.

Protocolo

1. Preparar amostras

1. Cultura 2 x 10⁶ células de câncer de cólon HT-29 produtoras de amilóide em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm em 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina. Cultivar células durante a noite em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   1. Depois que as células crescerem até 80% de confluência, lave-as com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicione 3 mL de solução de tripsina e incube a 37 °C por 3 min.
   2. Depois que as células estiverem totalmente dissociadas do prato, adicione 10 mL de meio de cultura e transfira as células com uma pipeta de 10 mL para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as células a 1.000 x g por 3 min em temperatura ambiente. Aspire o meio, ressuspenda as células em 5 mL de meio de cultura e conte as células usando um contador de células. Placa 2 x 10⁶ células em cada uma das duas placas de 10 cm.
   3. Permitir que as células adiram e recuperem durante a noite numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂. Aplique o tratamento em uma placa para induzir a formação de amilóides com 20 ng/mL de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), 100 nM de mimético de Smac e inibidor de pan-caspase de 20 μM Z-VAD-FMK. A combinação é abreviada como TSZ. Trate o outro prato com o veículo como controle.
2. Após o período de tempo apropriado, geralmente 6 h, colha o lisado celular.
   1. Raspe as células da placa com um raspador de plástico e use uma pipeta de 10 mL para transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as células a 1.000 x g por 3 min a 4 ° C.
   2. Lave as células 2 vezes ressuspendendo em 10 mL de PBS gelado e centrifugando a 1.000 x g por 3 min a 4 °C. Aspire a solução de PBS.
      nota: O processo pode ser pausado aqui congelando o pellet da célula em nitrogênio líquido e armazenando a ˗80 °C por até 1 mês.
   3. Transfira o pellet celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incube em 0,3 mL de tampão de lise por 30 min no gelo. Centrifugue a 20.000 x g por 15 min a 4 °C. O sobrenadante é o lisado celular inteiro.
      nota: O processo pode ser pausado aqui armazenando a amostra a -20 °C por vários meses.
   4. Meça a concentração de proteína por um ensaio de Bradford. Adicione 4x tampão de carga SDD-AGE para preparar 20 μL de amostra de 3 μg/μL e incube em temperatura ambiente por 10 min.

2. Prepare e execute géis

1. Adicione 2 g de agarose a 200 mL de 1x tampão de trisacetato (TAE) em um copo de vidro e aqueça no micro-ondas para derreter a agarose. Adicione 1 mL de SDS a 20% para uma concentração final de SDS a 0,1%. Gire cuidadosamente para misturar. Tome cuidado para não gerar bolhas após a adição do SDS.
2. Despeje a solução de agarose em uma placa de gel de 15 cm x 14 cm. Use uma pipeta de 1 mL para eliminar quaisquer bolhas. Coloque um pente de 20 poços no topo.
3. Primeira dimensão: pipetar 60 μg de lisado de células inteiras na faixa da extrema direita. Execute o gel a 60 V por cerca de 4 h (até que a frente do corante esteja cerca de 3/4 através do gel) usando o TAE contendo 0,1% de SDS como tampão de corrida.
4. Segunda dimensão: Gire cuidadosamente o gel 90° no sentido anti-horário (Figura 1A). Execute o gel a 60 V por cerca de 4 h.
   nota: A condição geral de funcionamento é de 4 V / cm de comprimento de gel. É importante que as condições de funcionamento sejam exatamente as mesmas para a primeira e segunda dimensões.

Resultados

Figura 1. Protocolo experimental.(A) Esquema da eletroforese bidimensional em gel de agarose em detergente semidesnaturante (2D SDD-AGE). Comece carregando a amostra na faixa mais à direita, rotulada em vermelho. Após o término da primeira dimensão, gire o gel 90° no sentido anti-horário. Execute a eletroforese de segunda dimensão. A seta sólida indica a direção da primeira cota, a seta pontilhada indi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
aparelho de eletroforese em gel	pescador	HE99XPRO	appratus para corrida em gel.
agrose	VWR	Rolamento 97062-250	Para gel de agarose.
DMEM	sigma	D6429	para cultura celular
Soro fetal bovino	sigma	Rolamento F4135	para cultura celular
penicilina-estreptomicina	sigma	Pág. 4333	para cultura celular
Solução de tripsina	sigma	T4049	para cultura celular
PBS para cultura de tecidos	sigma	D8662	para cultura celular
TNF recombinante	feito em nosso laboratório		para induzir necroptose. Ver referência 11.
mimético smac	presente do Dr. Xiaodong Wang		para induzir necroptose. Ver referência 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	para induzir necroptose. Ver referência 11.
Contador de células	Bio-Rad	1450102	Modelo TC20; para contagem de células
Kit de ensaio de proteína Pierce™ BCA	Thermo Científico	23225	para medir a concentração de proteínas em lisados celulares
Elevador de células	pescador	200/07/364	para remover células do prato
Tampão de lise (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL de glicerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inibidores de protease e fosfatos, conforme desejado)
10X TAE (1 L)			48,4 g Base Tris 11,42 mL de ácido acético glacial 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L
4X SDD-AGE tampão de carregamento (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL de glicerol 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% azul de bromofenol 31 mL ddH2O
Tampão de lavagem PBST (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL de interpolação20
10X PBS (10 L)			800 g de NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 adicionar ddH2O a 10 L