Eletroforese em gel de agarose semi-desnaturante bidimensional: uma técnica para separar fibras amilóides polimórficas com base na heterogeneidade de tamanho

Resumo

Fonte: Hanna-Addams, S., et al. Uso de eletroforese bidimensional em gel de agarose em detergente semidesnaturante para confirmar a heterogeneidade de tamanho de fibras amilóides ou semelhantes a amilóides. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a separação bidimensional semi-desnaturante de fibras amilóides em gel de agarose em gel de agarose. A técnica separa os agregados amilóides polimórficos com base em seu tamanho heterogêneo.

Protocolo

1. Preparar amostras

1. Cultura 2 x 10⁶ células de câncer de cólon HT-29 produtoras de amilóide em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm em 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina. Cultivar células durante a noite em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   1. Depois que as células crescerem até 80% de confluência, lave-as com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicione 3 mL de solução de tripsina e incube a 37 °C por 3 min.
   2. Depois que as células estiverem totalmente dissociadas do prato, adicione 10 mL de meio de....

Resultados

Figura 1. Protocolo experimental.(A) Esquema da eletroforese bidimensional em gel de agarose em detergente semidesnaturante (2D SDD-AGE). Comece carregando a amostra na faixa mais à direita, rotulada em vermelho. Após o término da primeira dimensão, gire o gel 90° no sentido anti-horário. Execute a eletroforese de segunda dimensão. A seta sólida indica a direção da primeira cota, a seta pontilhada indi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
aparelho de eletroforese em gel	pescador	HE99XPRO	appratus para corrida em gel.
agrose	VWR	Rolamento 97062-250	Para gel de agarose.
DMEM	sigma	D6429	para cultura celular
Soro fetal bovino	sigma	Rolamento F4135	para cultura celular
penicilina-estreptomicina	sigma	Pág. 4333	para cultura celular
Solução de tripsina	sigma	T4049	para cultura celular
PBS para cultura de tecidos	sigma	D8662	para cultura celular
TNF recombinante	feito em nosso laboratório		para induzir necroptose. Ver referência 11.
mimético smac	presente do Dr. Xiaodong Wang		para induzir necroptose. Ver referência 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	para induzir necroptose. Ver referência 11.
Contador de células	Bio-Rad	1450102	Modelo TC20; para contagem de células
Kit de ensaio de proteína Pierce™ BCA	Thermo Científico	23225	para medir a concentração de proteínas em lisados celulares
Elevador de células	pescador	200/07/364	para remover células do prato
Tampão de lise (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL de glicerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inibidores de protease e fosfatos, conforme desejado)
10X TAE (1 L)			48,4 g Base Tris 11,42 mL de ácido acético glacial 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L
4X SDD-AGE tampão de carregamento (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL de glicerol 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% azul de bromofenol 31 mL ddH2O
Tampão de lavagem PBST (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL de interpolação20
10X PBS (10 L)			800 g de NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 adicionar ddH2O a 10 L