Multimer-PAGE para separação de complexos de proteínas nativas: uma técnica de separação híbrida que consiste em Blue Native-PAGE e SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas do lisado tecidual

Abstract

Fonte: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Um método para capturar e resolver complexos de proteínas em amostras biológicas. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve o PAGE multimérico para separar complexos de proteínas nativas de homogeneizados de tecidos. A técnica é um híbrido das técnicas PAGE e SDS-PAGE nativas azuis. Os complexos separados podem ser caracterizados e estudados por seu papel no funcionamento celular.

Protocol

1. Preparação de tecidos

1. Prepare 10 mL de 4x BN-PAGE tampão de amostra (200 mM Bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% p / v glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2).
   nota: Esta solução-mãe pode ser preparada previamente e conservada a 4 °C.
2. Diluir 250 μL de tampão de amostra 4x em 750 μL dH₂O contendo 1x coquetel inibidor de protease comercial. Vórtice e frio no gelo.
3. Homogeneizar 20 mg de tecido-alvo no tampão de amostra BN-PAGE de 1 mL 1x gelado com 30 golpes de um homogeneizador limpo.
   nota: Para este experimento de demonstração, o tecido-alvo é todo o tecido cerebral de rato. Após a homogeneização, as amostras podem ser tratadas com um detergente neutro, como digitonina a 2%, para solubilizar e permitir a eletroforese de proteínas de membrana.
4. Transfira o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 14.000 x g por 30 min para granular o conteúdo celular insolúvel. Após centrifugação, decantar o sobrenadante para um tubo limpo sobre gelo.
5. Siga as instruções do fabricante para medir a concentração de proteína sobrenadante usando ácido bicinconínico (BCA) ou ensaio de quantificação de proteína semelhante.
6. Se a(s) amostra(s) homogeneizada(s) contiver(em) detergente, adicionar uma quantidade de 5% de Coomassie Blue G-250 em uma solução aquosa suficiente para levar a solução homogeneizada a 0,25% de Coomassie.

2. PÁGINA BN

1. Dilua 25 mL de estoque tampão de eletroforese nativo azul 20x azul (BN) (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricina, pH 6,8) em 475 mL dH₂O contendo 0,002% de Coomassie Blue para fazer 500 mL de 1x tampão de corrida.
   1. Se as amostras contiverem detergente, faça 250 mL de 1x tampão de corrida contendo 0,02% de Coomassie e outros 250 mL não contendo nenhum.
2. Refrigerar o(s) tampão(s) a 4 °C.
3. Limpe e monte um de vazamento de gel de poliacrilamida de acordo com as instruções do fabricante.
4. Despeje o gel de poliacrilamida BN (camada de empilhamento de 3% T, camada de resolução de 6% T) de acordo com uma receita padrão e coloque o pente bom.
5. Após a polimerização dos géis, enxágue o com dH₂O e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
6. Remova o pente do poço e encha os poços com 1x buffer de corrida BN-PAGE. Evite encher toda a câmara interna com tampão até que as amostras sejam carregadas.
   1. Se as amostras contiverem detergente, encha os alvéolos com o tampão contendo 0,02% de Coomassie Blue.
      NOTA: Execute as etapas 2.7-2.9 a 4 °C.
7. Usando pontas de carregamento de gel, pipetar um volume de homogenato contendo 20 μg de proteína para os alvéolos desejados. Pipete um volume equivalente de 1x tampão de amostra BN-PAGE em qualquer poço não utilizado.
   nota: Use a concentração de proteína determinada a partir do ensaio BCA para calcular o volume apropriado do homogeneizado a ser adicionado aos poços.
8. Depois que as amostras forem carregadas, encha a câmara interna com 1x buffer de corrida BN-PAGE. Certifique-se de que o gel esteja totalmente submerso em tampão. Em seguida, encha a câmara externa com 1x buffer de corrida até o nível indicado pelo fabricante.
   1. Se as amostras contiverem detergente, encha a câmara interna com o tampão 1x contendo 0,02% de Coomassie Blue e a câmara externa com 1x tampão de corrida sem corante.
9. Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e eletroforese as proteínas no gel a 150 V até que a banda de corante progrida ~ 2 cm na camada de resolução. Pare e desconecte a fonte de alimentação.

3. Reticulação

NOTA: Execute as etapas 3.1-3.6 a 4 °C.

1. Desmonte o aparelho de eletroforese e separe os painéis de vidro do de gel. Remova e descarte a camada de empilhamento.
2. Corte cuidadosamente o gel logo abaixo da borda inferior da frente do corante. Tome cuidado para tornar este corte o mais liso e reto possível e, em seguida, descarte o pedaço de gel não utilizado. Isso deixará uma tira horizontal de ~ 2 cm de largura de gel de poliacrilamida, que conterá toda a proteína na amostra homogeneizada.
3. Apare todas as porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel.
4. Coloque cuidadosamente a tira em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um recipiente pequeno e misture suavemente por nutação por 30 min para equilibrar.
5. Após o equilíbrio, descarte e substitua o PBS por mais 10 mL. Pipete 500 μL de DSP 25 mM dissolvido em dimetilsulfóxido no PBS e continue misturando como acima (etapa 3.4) por 30 min.
6. Despeje a solução DSP. Adicione 10 mL de cloridrato de tris (hidroximetil) aminometano 0,375 M (Tris-HCl), pH 8,8, contendo 2% de dodecil sulfato de sódio (SDS) para extinguir o DSP não reagido. Continue a nutação por 15 min.

4. PÁGINA SDS

1. Enquanto a tira de gel está resfriando, prepare as soluções de gel SDS-PAGE de acordo com os métodos padrão. Não adicione reagentes de polimerização.
2. Após a têmpera, retorne a tira de gel ΒΝ à temperatura ambiente e funda a tira em um novo de gel.
   1. Para fazer isso, pegue cuidadosamente o gel e coloque-o em uma placa espaçadora de de gel limpa.
   2. Oriente a tira de forma que a parte inferior da frente do corante fique mais próxima da parte superior de um novo (ou seja, o lado que viajou mais longe durante o BN-PAGE deve estar mais próximo do topo do novo; a tira de gel deve ser invertida de sua orientação anterior). Veja a Figura 1.
   3. Coloque a tira de forma que sua borda superior fique nivelada com a borda superior da placa de cobertura (ou seja, estará na parte superior do novo gel). Certifique-se de que a frente da tinta esteja paralela às bordas horizontais da placa de vidro.
   4. Empurre um lado da tira excisada contra uma das paredes espaçadoras, deixando espaço do outro lado para o gel ser derramado e um padrão de proteína ou escada a ser carregado.
   5. Se a borda inferior da tira de gel contiver áreas irregulares ou irregulares, corte-as com cuidado. Se presentes, eles irão prender bolhas durante o vazamento do gel.
   6. Assim que a tira de gel estiver posicionada corretamente, coloque a placa de cobertura sobre a placa espaçadora. Aplique uma leve pressão para empurrar para fora as bolhas de ar presas.
   7. Continue a montar o aparelho de vazamento de gel de acordo com as instruções do fabricante.
3. Adicione reagentes de polimerização ao tampão de gel de resolução e despeje-o no de gel preparado, usando uma pipeta sorológica. Encha o de gel até ~ 2 cm abaixo da tira de gel BN-PAGE excisada, para deixar espaço para a camada de empilhamento.
4. Adicione 100 μL de butanol por cima do gel derramado e aguarde 30 min para a polimerização da camada de resolução. Despeje o butanol.
5. Adicione reagentes de polimerização à solução de gel de empilhamento. Usando uma pipeta sorológica, despeje a camada de empilhamento para preencher todo o espaço vazio restante no de gel.
   1. Incline o de gel à medida que a camada de empilhamento é derramada para preencher o espaço abaixo da tira de gel e as bolhas de ar não fiquem presas.
   2. À medida que o buffer de gel de empilhamento preenche o espaço vazio abaixo da tira de gel, retorne gradualmente o de gel para o nível da base.
   3. Continue a preencher o espaço vazio ao lado da tira de gel excisada com o tampão de gel de empilhamento, até que quase transborde.
6. Deixe a camada de empilhamento polimerizar por 30 min.
   nota: Faça 10x SDS-PAGE executando tampão (250 mM tris (hidroximetil) aminometano (tris), 1,9 M glicina, 1% SDS) enquanto o gel está polimerizando. Isso também pode ser feito com antecedência e armazenado em temperatura ambiente.
7. Dilua 50 mL de estoque regulador de execução 10x SDS-PAGE em 450 mL dH₂O para fazer 1x buffer de trabalho.
8. Após a polimerização da camada de empilhamento, remova o de gel do aparelho de vazamento, enxágue com dH₂O e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
9. Encha a câmara interna completamente com 1x buffer de corrida SDS-PAGE e, em seguida, encha a câmara externa até o nível indicado pelo fabricante.
10. Carregar o espaço junto à tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou um padrão de proteína adequado.
11. Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e eletroforize as amostras a 120 V. Quando o corante Coomassie sair do gel, pare e desconecte a fonte de alimentação.
12. Analise o gel usando métodos padrão de eletroblotting e detecção de proteínas por ligação de anticorpos.

Results

Figura 1: Fluxograma geral de multímero-PAGE.
(A) Preparar lisado tecidual usando métodos não desnaturantes, como homogeneização em tampão de amostra BN-PAGE. (B) Pipetar lisado em gel BN-PAGE e, em seguida, realizar eletroforese (150 volts) em buffer de execução BN-PAGE. Deixe a amostra migrar até que a frente do corante tenha migrado ~ 2 cm para o gel de resolução. (C

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produtos químicos
Ácido ε-aminocapróico	sigma	A2504
acrilamida	Acros Orgânicos	164855000	tóxico.
Acrilamida/bisacrilamida 37,5:1 (solução estoque a 40% T)	BioRad	161-0148	tóxico.
Persulfato de amônio	sigma	Resposta 3678
IgG-HRP anti-coelho de cabra	Santa Cruz Biotecnologia	SC-2004
Kit de ensaio de ácido bicinconínico	Thermofisher	23225
Bis-tris	sigma	B9754
Albumina de soro bovino	sigma	Rolamento A9647
butanol	Fisher Científico	A399-1
Kit de substrato de quimioluminescência	ThermoFisher	Rolamento 24078
Azul Coomassie G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonina	sigma	D141	tóxico.
Dimetilsulfóxido	Fisher Científico	D128-1
Dithiobis (succinimidilpropionato)	Thermo Científico	22585
Leite desnatado em pó	LaboratórioCientífico	M0841
Glicerol	sigma	G9012
glicina	Fisher Científico	BP381-5
Coquetel Inibidor de Protease Halt	Thermofisher	Rolamento 78430
ácido clorídrico	Fisher Científico	Rolamento A144SI-212	Para titulação. Cáustico.
metanol	Fisher Científico	Resposta A412-4	Para ativação da membrana PVDF. Tóxico.
IgG monoclonal anti-α-sinucleína de coelho	Santa Cruz Biotecnologia	SC-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina	sigma	T9281
N,N'-metilenobisacrilamida	Acros Orgânicos	Rolamento 16479	tóxico.
NP40	Boston Bioprodutos	Pág. 872
Polissorbato 20 (tween-20)	Fisher Científico	BP337-500
Membranas de transferência de fluoreto de polivinilideno	Thermo Científico	Rolamento 88518
Ponceau S	sigma	Pág. 3504
Cloreto de potássio	Fisher Científico	Pág. 217-3
Fosfato de potássio monobásico	sigma	Pág. 9791
Coquetel de inibidores de protease	Thermo Científico	Rolamento 88265
Solução SDS (10% p/v)	BioRad	161-0416
cloreto de sódio	Fisher Científico	BP358-212
Dodecil sulfato de sódio	sigma	L37771
Fosfato de sódio monobásico	Fisher Científico	BP329-1
Tricina	sigma	T0377
Base Tris	Fisher Científico	BP152-500
Tris-HCl (tampão 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (tampão de 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Instrumentos
GE Imagequant LAS 4000	GE Saúde	28-9558-10
Software ImageJ NIH
Leitor de microplacas Synergy H1	BioTek
Formadora de Gel + Suporte	Biorad
Centrífuga Microfuge 22R	Beckman Coulter
Homogeneizador de 2 mL
Misturador de vórtice	Fisher Científico
Homogeneizador ultrassônico de tecidos	Fisher Científico	FB120220