Eletroforese capilar: uma técnica para analisar amplicons de reação em cadeia da polimerase marcados com fluorescência

Resumo

Fonte: Gulla, S. et al., Análise de repetição tandem de número variável multilocus da bactéria patogênica de peixes Yersinia ruckeri por PCR multiplex e eletroforese capilar. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve a técnica de eletroforese capilar para analisar amplicons de PCR marcados com fluorescência obtidos de várias amostras com base em seu tamanho. Ele gera um padrão migratório que determina os comprimentos dos pares de bases dos fragmentos com a ajuda do corante fluorescente marcado em cada fragmento.

Protocolo

1. Configuração da eletroforese capilar e condições de execução

1. Após a confirmação dos amplicons de PCR, diluir os produtos de PCR 1:10 (v/v) em água purificada. Sele, misture e centrifugue brevemente.
2. Trabalhando em uma capela de exaustão, prepare um volume de master mix consistindo de 9 μL de formamida e 0,5 μL de tamanho padrão por produto de PCR (permitir 10% do volume excedente). Faça um vórtice breve e distribua 9,5 μL em poços em uma placa apropriada para o sistema CE disponível antes de adicionar 0,5 μL de produto de PCR diluído. Sele, misture e centrifugue brevemente.
   CUIDADO: Manuseie com cuidado. A mistura de formamida com água gera ácido fórmico, que é tóxico.
3. Usando um termociclador de PCR, desnature as amostras a 95 °C por 3 min antes de resfriar a 4 °C indefinidamente. Centrifugue brevemente e carregue a placa em um sistema CE calibrado de acordo com as instruções do fabricante.
4. Execute a análise de fragmentos CE usando reagentes conforme apropriado para o aparelho de escolha e as seguintes configurações: 60 ° C; injeções de 5 s a 1,6 kV (32 V por cm); tempo de execução de 32 min a 15 kV (300 V por cm). A análise de fragmentos de CE de 24 poços em um capilar de 24 (50 cm) normalmente leva aproximadamente 50 minutos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Analisador Genético Avant 3500xL	Thermo Fisher Científico	A30469	Usado para análise de fragmentos de eletroforese capilar.
Mancha de ácido nucleico GelRed, 10.000X em água	Biotium	Nº 41003	Corante fluorescente de ácido nucleico usado durante a eletroforese em gel.
Software GeneMapper 5	Thermo Fisher Científico	4475073	Usado para ler eletroferogramas de eletroforese capilar.
Corante GeneScan 600 LIZ Tamanho Padrão v2.0	Thermo Fisher Científico	4408399	Tamanho padrão usado durante a eletroforese capilar.
Hi-Di Formamida	Thermo Fisher Científico	4311320/4440753	Formamida deionizada usada durante a eletroforese capilar. Prepare aliquouts de trabalho.
Água Milli-Q	NA	NA	Água purificada usada durante PCR e eletroforese capilar. Receita padrão; produzido internamente.
Polímero POP-7 para analisadores genéticos 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Científico	A26077/4393713/4393709	Matriz de separação usada durante a eletroforese capilar.
Sistema de imagem/visualização em gel baseado em UV	Como preferido.	NA
Vórtice	Como preferido.	NA