Eletroforese alcalina em gel de célula única: uma técnica sensível para estimativa quantitativa de danos ao DNA em células cancerígenas individuais após quimioterapia

Resumo

Fonte: Lu, Y., et al. Avaliando danos ao DNA in vitro usando o ensaio cometa J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de eletroforese alcalina de célula única para quantificar quebras de DNA de fita simples e dupla em células tratadas com doxorrubicina. As condições alcalinas interrompem as ligações de hidrogênio entre os pares de bases do DNA, resultando no desenrolamento completo e na separação das fitas de DNA. Isso permite a migração diferencial de fragmentos de DNA não danificados e danificados em gel de agarose após eletroforese, revelando uma estrutura em forma de cometa de DNA não danificado de migração lenta formando a cabeça circular do cometa e fragmentos de DNA danificados migrando rapidamente formando a cauda alongada do cometa.

Protocolo

1. Preparar reagentes

1. 1x PBS
   1. Dilua 100 mL 10x PBS com 900 mL dH₂O e ajuste o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazene em temperatura ambiente.
2. Solução de lise (LS)
   1. Prepare 2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA dissódico, 10 mM de base Tris e 200 mM de NaOH em 900 mL dH₂O; geralmente leva cerca de 20 minutos para permitir que a mistura se dissolva completamente. Ajuste o pH para 10 usando um medidor de pH. Adicione 1% de lauril sarcosinato e 1% de Triton X-100 e ajuste o volume final para 1.000 mL. Resfrie a 4°C por pelo menos 30 min antes de usar.
3. Solução alcalina de eletroforese (AES), pH >13
   1. Prepare 200 mM de NaOH e 1 mM de EDTA dissódico em 800 mL dH₂O. Ajuste o pH e certifique-se de que é pH >13. Ajuste o volume final para 1.000 mL. Fazer fresco antes de usar e arrefecer a 4°C durante pelo menos 30 minutos antes de usar
4. Solução de coloração
   1. 1. Adicione 1 μL de corante de ácido nucleico fluorescente verde 10.000x (por exemplo, SYBR Green) em 30 mL de tampão Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA dissódico, pH 7,4) e armazene a 4 ° C. Proteja da luz.
5. 1% de baixo ponto de fusão de agarose
   1. Derreta 1% de agarose de baixo ponto de fusão (1 g em 100 mL dH₂O) no micro-ondas. Agite a agarose a cada 15-20 s para se certificar de que a agarose está completamente derretida. Coloque a agarose em banho-maria a 37°C por pelo menos 20 min antes de usar.
6. Ponteiras de pipeta pré-aquecidas
   1. Corte as extremidades estreitas das pontas da pipeta P200 em 3 mm e aqueça a 37 ° C antes de pipetar a agarose.

2. Preparar slides do Comet

1. Revestimento deslizante
   1. Derreta a 1% de agarose (1 g em 100 mL dH₂O) no microondas por 2 a 3 min ou até que a agarose esteja completamente derretida. Mergulhe as lâminas do microscópio de vidro na agarose e limpe um lado da lâmina usando um pano sem fiapos.
   2. Coloque as lâminas em uma superfície plana para secar ao ar ou aquecer a 50 ° C para uma secagem mais rápida; um filme transparente de agarose deve ser formado após a secagem. Coloque as lâminas revestidas a 37°C antes de usar.
2. Preparação de suspensões unicelulares
   1. Cultura e tratamento da célula de glioma
      1. Cultivar as células U251 MG em meio DMEM-Ham F-12 suplementado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 10 μg/mL de estreptomicina a 37°C com 5% de CO₂.
      2. Digerir as células usando 1 mL de tripsina por 3 min e neutralizar a tripsina usando o meio DMEM-Ham F-12 com FBS. Colete em tubo de 15 mL, gire a 300 x g por 4 min, aspire o meio e suspenda as células a 2 x 10⁵ células/mL em 1x PBS.
         nota: A amostra de células deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio e todas as amostras devem ser manuseadas em um ambiente escuro ou escurecido para evitar danos ao DNA causados pela luz.
      3. Combine a suspensão celular com 1% de agarose de baixo ponto de fusão fundido (a 37 ° C) na proporção de 1:10 (v / v), misture delicadamente pipetando para cima e para baixo e pipete imediatamente 30 μL em uma lâmina revestida de agarose. Use a lateral da ponta da pipeta para espalhar a mistura de agarose/célula para garantir a formação de uma camada fina.
      4. Coloque a lâmina plana a 4°C no escuro por 10 min. Aumentar o tempo de gelificação para 30 min melhora a aderência das amostras em ambientes de alta umidade.
      5. Mergulhe o escorregador em 4 ° C LS no escuro por 1 h a durante a noite.
3. Eletroforese de célula única
   1. Para ensaio de cometa alcalino
      1. Remova suavemente as lâminas do LS, drene o excesso de tampão e mergulhe suavemente em AES por 1 h a 4 ° C para permitir o desenrolamento do DNA. Mantenha os slides no escuro.
      2. Adicione AES pré-resfriado na bandeja de lâminas de eletroforese, não exceda 0,5 cm acima das lâminas (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque as lâminas dentro e cubra com uma tampa. Defina a fonte de alimentação voltage para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e execute por 30 min a 4°C.
      3. Drene o excesso de solução de eletroforese da lâmina. Mergulhe suavemente as lâminas duas vezes em dH₂O por 5 min cada em temperatura ambiente.
      4. Mergulhe suavemente as lâminas em etanol a 70% por 5 min em temperatura ambiente. Prossiga para a coloração.
4. Slides de cometa de mancha
   1. Lâminas secas a 37°C durante 10 - 15 min no escuro.
   2. Coloque 50 - 100 μL de solução de coloração de ácido nucleico fluorescente verde em cada agarose seca e core por 15 min em temperatura ambiente no escuro.
   3. Enxágue as lâminas brevemente em dH₂O e seque completamente a 37°C no escuro. Prossiga para a aquisição e análise de imagens.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x PBS (Ca++, Mg++ livre)	TEKnova	Pág. 0196
NaCl	sigma	S5886
Edta	TEKnova	E0308
Trizma base	sigma	T1503
NaOH	sigma	Nº 72068
Lauril sarcosinato de sódio	sigma	L7414
Tritão X-100	sigma	Rolamento 93443
SYBR Verde	Invitrogen	S33102
Baixo ponto de fusão de agarose	Invitrogen	16520
agarose	Invitrogen	16500
Etanol 95%	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
tripsina	GIBCO	Rolamento 25300-054
Lâminas de tecido de vidro	CIÊNCIAS DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA	Nº 63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Denville
Ponteiras de pipeta	afiado
microondas	Avanti
Banho-maria	precisão
Câmara de eletroforese horizontal	TREVIGEN	Ensaio Cometassay ES II
fonte de alimentação	Bio-Rad
incubadora	Laboratório Quincy	Modelo 12-140E
Microscópio fluorescente	Zeiss	LSM700
Micropipetador	Eppendorf