Eletroforese capilar microfluídica para dimensionamento de fragmentos de produtos de PCR: uma técnica de separação eletroforética baseada em microchip para separar fragmentos de DNA com base no tamanho

Resumo

Fonte: Wang, H., Zhu et al. Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeos de citosina-guanina-guanina no gene de retardo mental X frágil-1. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica de eletroforese capilar microfluídica para separar amplicons de PCR com base em seu tamanho. Essa técnica ajuda no dimensionamento de fragmentos usando corantes fluorescentes e marcadores de tamanho molecular padrão.

Protocolo

1. Dimensionamento de fragmentos de produtos de PCR

1. Antes de começar, deixe o concentrado de corante de DNA, a matriz de gel de DNA, o marcador de DNA, a escada de DNA e as amostras de DNA purificadas equilibrarem à temperatura ambiente por 30 min.
2. Configurar a estação de escorva
   1. Substitua a seringa (consulte a Tabela de Materiais) ao usar um novo lote de reagentes.
   2. Ajuste a placa de base, solte a alavanca do clipe da seringa e deslize-a para a posição superior.
3. Inicie o software de colagem (consulte a Tabela de Materiais) e prepare a mistura de gel e corante.
4. O corante de vórtice se concentra por 10 s e gira para baixo. Adicione 25 μL do corante a um frasco para injetáveis de matriz de gel. Vortex bem a solução misturada e gire para baixo.
   1. Transfira a mistura de gel-corante para um filtro de centrifugação. Coloque o filtro de centrifugação em uma microcentrífuga e gire por 10 min em temperatura ambiente a 1.500 x g ± 20%.
      NOTA: Proteja a solução com corante da luz e armazene a 4 ° C após o uso. A mistura de gel-corante pode ser usada para cerca de 15 chips depois de preparada. Deixe a mistura de gel-corante equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos de cada vez antes de usar.
5. Carregue a mistura de gel-corante
   1. Insira um novo chip de DNA na estação de preparação. Adicione 9 μL de mistura de gel-corante no poço marcado com "G". Certifique-se de que o êmbolo esteja posicionado na marca de 1 mL e, em seguida, feche a estação de escorva.
   2. Pressione o êmbolo da seringa para baixo até que seja segurado pelo clipe. Aguarde exatamente 30 s e solte o clipe. Aguarde 5 s e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo de volta para a posição de 1 mL.
   3. Abra a estação de escorva e adicione 9 μL de mistura de gel-corante nos poços marcados com "G".
6. Adicione 5 μL de marcador no poço marcado com o símbolo da escada e também adicione 5 μL de marcador em cada um dos 12 poços de amostra. Não deixe nenhum poço vazio.
7. Adicione 1 μL de escada de DNA no poço marcado com o símbolo da escada. Adicione 1 μL de produto de PCR (poços usados) ou 1 μL de água ultrapura (poços não utilizados) em cada um dos 12 poços de amostra. Coloque o chip horizontalmente no adaptador do misturador de vórtice e vórtice por 1 min na configuração indicada (2,400 rpm).
8. Insira o chip no instrumento do bioanalisador e execute o chip no instrumento dentro de 5 min.
9. Após a conclusão do ensaio, remova imediatamente o chip usado do instrumento.
10. Adicione lentamente 350 μL de água deionizada em um dos poços do limpador de eletrodos. Abra a tampa do bioanalisador e coloque o limpador de eletrodos nela. Feche a tampa e incube por cerca de 10 s. Abra a tampa e remova o limpador de eletrodos. Aguarde mais 10 segundos para permitir que a água nos eletrodos evapore e feche a tampa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumento bioanalisador Agilent 2100: tubos de PCR de 0,2 mL	Axygen	PCR-02D-C
Instrumento bioanalisador Agilent 2100: 1x tampão TE, pH 8,0, sem Rnase	Ambion	AM9849
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Instrumento 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Placa PCR de 96 poços	Thermo Fisher	AB0800
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Cartucho de eletrodo	Agilent		Fornece equipamentos do instrumento Bioanalyzer 2100
Instrumento bioanalisador Agilent 2100: misturador de vórtice IKA	Agilent		Fornece equipamentos do instrumento Bioanalyzer 2100
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Software de dimensionamento 2100 Software Expert	Agilent		Fornece equipamentos do instrumento Bioanalyzer 2100
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Chips de teste	Agilent		Fornece equipamentos do instrumento Bioanalyzer 2100
Kit Agilent DNA 7500	Agilent	Rolamento 5067-1506	Para dimensionamento de fragmentos
Kit Agilent DNA 7500: Escada DNA 7500 (tampa amarela)	Agilent		No kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Marcadores DNA 7500 (tampa verde)	Agilent		No kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: chips de DNA	Agilent		No kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Concentrado de corante de DNA (tampa azul)	Agilent		No kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Frasco de matriz de gel de DNA (tampa vermelha)	Agilent		No kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Limpador de eletrodos	Agilent		No kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Filtro de rotação	Agilent		Suprimentos do kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Seringa	Agilent		Suprimentos do kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Estação de preparação de cavacos	Agilent	Rolamento 5065-4401	Fornece equipamentos do instrumento Bioanalyzer 2100
Coletor de vácuo de placa filtrante: Coletor de vácuo MultiScreenHTS	Merck Millipore	MSVMHTS00	Instrumento de vácuo para coletor de vácuo de placa de filtro para purificação de produtos PCR
Coletor de vácuo da placa filtrante: rolha de silicone	Merck Millipore	XX2004718	Coletor de vácuo da placa filtrante
Coletor de vácuo da placa filtrante: Bomba de vácuo	Merck Millipore	WP6122050	Coletor de vácuo da placa filtrante
Coletor de vácuo de placa filtrante: Recipiente de coleta de resíduos	Merck Millipore	XX1004705	Coletor de vácuo da placa filtrante