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1. Bloqueio de resíduos de cisteína livre usando iodoacetamida
- Cultive células U-2 OS em um prato de 6 cm2 a 50% -60% de confluência em meio essencial mínimo com glicose alta contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de piruvato de sódio a 37 ° C em 5% de CO2.
- Faça um novo estoque de 10 mM de iodoacetamida imediatamente antes de usar e, em seguida, descarte qualquer reagente não utilizado.
- Adicione iodoacetamida de concentração final de 0,1 mM diretamente ao meio de cultura celular. Agite suavemente o prato em temperatura ambiente por 2 min.
2. Colhendo as células
- Aspire o meio das células.
- Lave as células com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) três vezes. Aspire a solução final de lavagem de PBS e adicione 1 mL de PBS frio.
- Raspe as células do fundo do prato usando um raspador de células. Usando uma pipeta de 1 mL, retire o PBS e a suspensão celular e distribua todo o líquido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Gire as células a 7.500 x g por três min a 4 ° C. Aspire o PBS, deixando o pellet celular para trás. O pellet celular pode ser armazenado a -80 °C até o processamento
3. Extração de proteína
- Prepare 100 μL de um tampão de lise 1x diluído em ddH2O (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) imediatamente antes da utilização até uma concentração final de 1 mM.
- Adicione 50 μL do tampão de lise 1x diretamente ao pellet da célula e suspenda. Incube no gelo por 5 min.
- Sonicar por 8 s usando o modo de pulso constante a 40% (ver Tabela de Materiais para sonicador; ajuste conforme necessário para diferentes sonicadores), mantendo o extrato no gelo.
- Centrifugar o extracto a 4 °C durante 5 min a 16 000 x g. O sobrenadante é a fração de proteína solúvel. A análise de Bradford pode ser realizada para determinar a concentração de proteína, se desejado.
4. Preparação de amostras
- Pegue 10 μL do extrato de proteína solúvel e adicione 10 μL de um tampão de amostra 1x Laemmli SDS (4% SDS, 20% de glicerol, 0,004% de azul de bromofenol e 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Não adicione nenhum reagente redutor.
- Mantenha as amostras no gelo se a análise SDS PAGE for realizada naquele dia; para armazenamento de longo prazo, -20 ° C é apropriado. Logo antes de passar o gel, aqueça a amostra por 5 min a 85 °C.
5. Reticulação de formaldeído in vivo de proteínas endógenas em células U-2 OS
- Cultive células U-2 OS em um frasco de 175 cm2 até 70% a 80% de confluência.
- Execute a reação de reticulação de formaldeído
- Em uma capela de exaustão, alíquota de uma solução de formaldeído a 37% comprada de fontes comerciais. Adicione o fixador de formaldeído diretamente ao meio até uma concentração final de 1% e incube em temperatura ambiente com agitação suave por 15 min.
- Para extinguir a reação, adicione 1,25 M de glicina a uma concentração final de 0,125 M e incube à temperatura ambiente com agitação suave em um balancim por 5 min.
- Lave as células com 5 mL de PBS frio três vezes. Aspire a solução final de lavagem de PBS e adicione 10 mL de PBS. Raspar as células do fundo do balão com um raspador de células.
- Usando uma pipeta de 10 mL, retire o PBS e a suspensão celular e distribua todo o líquido em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Girar as células a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Aspirar o PBS, deixando o sedimento celular para trás.
6. Fracionamento de Núcleos
- Prepare 10 mL de tampão de homogeneização: sacarose 0,25 M, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM e BSA 0,5% em pH 7,4. Adicione PMSF imediatamente antes do uso a uma concentração final de 1 mM e 3mL de tampão de suspensão de núcleos (0,1% Triton X-100 em PBS).
- Adicione 5 mL de tampão de homogeneização diretamente ao pellet celular e suspenda completamente. Centrifugar a suspensão a 500 x g durante 2 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
- Suspenda o pellet em 5 mL de tampão de homogeneização. Use um homogeneizador de vidro-Teflon bem ajustado, homogeneize as células a 10 golpes / 500 rpm.
- Centrifugar a suspensão a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C e, em seguida, rejeitar o sobrenadante.
NOTA: Use o sobrenadante para isolamento de mitocôndrias centrifugando a 10.000 x g por 10 min.
- Suspenda o pellet em tampão de suspensão de núcleos de 1 mL e incube em gelo por 10 min.
- Centrifugue a 600 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante.
- Suspenda o pellet em 1 mL de tampão de suspensão de núcleos e centrifugue novamente. Descarte o sobrenadante. O pellet final será de núcleos isolados.
7. Extração de Proteína
- Repita a seção 4, exceto adicionando 25 μL do tampão de lise 1x diretamente ao pellet da célula e depois suspendendo.
8. Preparação da amostra
- Prepare duas amostras para SDS-PAGE tomando 10 μL de cada extrato de proteína solúvel e adicione 10 μL de tampão de amostra 2x Laemmli SDS e 1 μL de 2-mercaptoetanol (BME).
- Aquecer uma amostra durante 5 min a 37 °C e a segunda amostra durante 15 min a 98 °C para inverter a reticulação do formaldeído.
9. Análise SDS-PAGE
- Prepare 1 L de 1x tampão de corrida Tris-glicina (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0,1% (p / v) SDS).
- Configurar o SDS-PAGE executando o aparelho.
NOTA: Este protocolo usa uma página TGX SDS pré-moldada de 16%. É importante notar que qualquer gel de porcentagem pode ser usado.
- De acordo com o protocolo do fabricante, abra a embalagem em que o gel está armazenado e remova o.
- Remova o pente que está revestindo os poços e a fita da parte inferior do.
- Coloque o gel no aparelho de corrida.
- Encha a câmara com o tampão de corrida 1x até que os poços estejam submersos em líquido. Usando uma pipeta de plástico, enxágue os poços com o tampão de corrida.
- Coloque as amostras no gel junto com o marcador padrão prestado de 10 μL.
- Execute o gel a 200 V até que a frente do corante esteja a aproximadamente 1 cm da parte inferior do gel.