SDS Page não redutor: um método para analisar complexos de proteínas multiméricas ligadas a dissulfeto

Resumo

Fonte: Rotoli, S. M. et al., Combinando Análise SDS-PAGE Não Redutora e Reticulação Química para Detectar Complexos Multiméricos Estabilizados por Ligações de Dissulfeto em Células de Mamíferos em Cultura. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica de separação das amostras de proteínas por SDS-PAGE não redutor para analisar os complexos de proteínas multiméricas. Esta técnica retém as subunidades multímeras de uma proteína mantida pelas ligações dissulfeto que podem ser posteriormente analisadas por western blotting.

Protocolo

1. Bloqueio de resíduos de cisteína livre usando iodoacetamida

1. Cultive células U-2 OS em um prato de 6 cm² a 50% -60% de confluência em meio essencial mínimo com glicose alta contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de piruvato de sódio a 37 ° C em 5% de CO₂.
2. Faça um novo estoque de 10 mM de iodoacetamida imediatamente antes de usar e, em seguida, descarte qualquer reagente não utilizado.
3. Adicione iodoacetamida de concentração final de 0,1 mM diretamente ao meio de cultura celular. Agite suavemente o prato em temperatura ambiente por 2 min.

2. Colhendo as célu....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% de géis TGX pré-fabricados	ThermoFisher	Xp00160
Azul de Bromofenol
Bsa	Sinalização celular	Rolamento 99985
Tampão de lise celular	Sinalização celular	Rolamento 9803
centrifuga	Eppendorf	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Edta	Sigma Aldrich	M101
Aparelho de eletroforese	Invitrogen	Rolamento A25977
Soro fetal bovino	Gibco	1932693
Formaldeído	ThermoFisher	Rolamento 28908
Homogeneizador de vidro-teflon
Glicerol	Sigma Aldrich	Nº 65516
glicina	RPI	Nº 636050
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Iodoacetamida	ThermoFisher	Nº 90034
Pbs	Sigma Aldrich	Pág. 3813
fonte de alimentação	Biorad	Rolamento 200120
Marcador Prestained	ThermoFisher	Nº 26619
Sds	Biorad	Telefone: 161-0302
Soniador	Branson	450
Base Tris	RPI	T60040
Solução salina tamponada Tris	Sigma Aldrich	SRE0031	com interpolação 20, pH 7,5
Tampão de corrida Tris-Glicina	VWR	J61006
Tritão X-100	Sigma Aldrich	T8787
Sistema operacional U-2	ATCC	HTB-96