Focalização isoelétrica em fase líquida: uma técnica de eletroforese para separar moléculas bioativas do extrato bruto de Gymnema sylvestre

1. Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato de Gymnema sylvestre

1. Meça 0,6 g de extrato vegetal e dissolva em água destilada (60 mL) misturando em um tubo de rolo por 5 min.
   NOTA: Qualquer amostra biológica solúvel e livre de sal pode ser usada para separação e purificação usando um instrumento de foco isoelétrico (IEF) em fase líquida. Amostras com concentração de sal tampão de até 10 mM podem ser usadas com resolução ligeiramente reduzida.
2. Centrifugue o extrato vegetal solubilizado a 10.000 x g por 5 min para remover as partículas insolúveis.
3. Transfira o sobrenadante (~ 60 mL) para um tubo de centrífuga de 80 mL e misture com 0,6 mL de anfólito (pH 3-10) a 1% (v / v).
4. Prepare a unidade IEF em fase líquida.
   1. Monte os eletrodos IEF em fase líquida (botão vermelho-ânodo e botão preto-cátodo) com suas respectivas membranas de troca de acordo com o manual de instruções (Tabela de Materiais). Equilibre as membranas de troca aniônica com NaOH 0,1 M e as membranas de troca catiônica com 0,1 M H₃PO₄ pelo menos por 16 h quando novas membranas forem usadas.
   2. Armazene as membranas em eletrólitos (0,1 M NaOH ou 0,1 M H₃PO₄) entre as corridas e não deixe secar.
   3. Monte a parte interna e externa do eletrodo alinhando três orifícios oblongos nas juntas de troca iônica. Encha os eletrodos com os respectivos eletrólitos (~ 25-30 mL) para evitar que suas membranas sequem.
   4. Não adicione excesso (mais de 1/3 do volume da câmara do eletrodo) de eletrólito que possa aumentar a pressão dentro do eletrodo e causar vazamento.
   5. Cubra as portas de coleta de amostras com fita de vedação que acompanha as peças de montagem do instrumento (Tabela de Materiais). O lado das portas de coleta de amostras pode ser identificado pelos dois pinos de alinhamento de metal verticais. Como alternativa, use fita de vedação padrão para vedar as portas.
   6. Monte todas as partes do conjunto da câmara de focagem em sequência (eletrodo anódico, núcleo de membrana de nylon, câmara de foco e eletrodo catódico) sobre o dedo de resfriamento cerâmico.
   7. Encha a câmara de foco com água destilada pré-resfriada (volume total de 60 mL para a célula IEF padrão) usando uma seringa de 50 mL.
   8. Conecte o instrumento IEF de fase líquida a uma água de resfriamento circulante a 4 ºC e pré-opere a unidade a 15 W e 3.000 V por 3-5 min ou até que a tensão se estabilize.
      NOTA: Geralmente, dentro de um minuto, a tensão atingirá os valores máximos definidos. A pré-execução com água destilada ajuda a remover os íons residuais da câmara de foco e do núcleo da membrana de nylon.
   9. Desligue a fonte de alimentação e remova a água da célula usando o coletor de frações. Sele novamente as portas de coleta com fita adesiva. A câmara está agora pronta para carregar a amostra.
5. Use uma seringa de 50 mL com uma agulha romba de 1-1/2 polegada e 19 G (vem com o instrumento) e carregue a amostra preparada com anfólito (60 mL no total) na célula através das portas de coleta de amostras.
6. Remova as bolhas de ar da célula de amostra removendo a célula de foco do suporte e batendo na câmara do eletrodo para desalojar as bolhas. A presença de bolhas de ar causará flutuações de tensão e corrente e afetará a corrida.
7. Conecte a unidade ao refrigerante de água (4 °C) e inicie o fracionamento com a fonte de alimentação a uma constante de 15 W.
8. Opere o aparelho por 3 h ou até que a tensão atinja um valor constante.
   NOTA: À medida que a amostra começa a focar, a tensão começará a subir gradualmente até atingir um valor constante.
9. Após a corrida, prepare-se para coletar as frações na caixa de colheita (contendo 20 tubos de plástico, 12 mm x 75 mm, volume de 5-6 mL) conectada à bomba de vácuo pressionando o botão de colheita ON na unidade IEF.
10. Alinhe os 20 pinos de coleta com as 20 portas de coleta da célula de foco que está selada com a fita.
11. Empurre os pinos de coleta através da fita de vedação e ligue a bomba de vácuo simultaneamente (Figura 1B, 1C e 1D).
    NOTA: Cerca de 3 mL frações de cada câmara serão coletadas nos tubos para cada vez. As frações podem ser usadas para aplicações subsequentes a jusante (SDS-PAGE para quantificação de peptídeos, TLC e bioensaio para pequenas moléculas).

Figura 1: Configuração do aparelho IEF em fase líquida e fracionamento do extrato da planta G. sylvestre. (A) Durante a execução, (B) durante a coleta de frações, (C) após a coleta de frações e (D) peças do aparelho IEF em fase líquida, 1) membranas de troca iônica, 2) câmara de foco e núcleo da membrana, 3) conjunto de eletrodos (negativo), 4) conjunto de eletrodos (positivo).