Eletroforese capilar de afinidade por deslocamento de mobilidade: um método para analisar as interações amostra-ligante dependendo da migração diferencial de complexos proteína-ligante

Resumo

Fonte: Nachbar M. et al., Análise do distúrbio intrínseco AtHIRD11 e ligação a íons metálicos por eletroforese capilar em gel e eletroforese capilar de afinidade. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve o método para analisar a interação proteína-ligante por eletroforese capilar de afinidade de mudança de mobilidade. Este método pode ser usado para caracterizar o comportamento de ligação de uma proteína com vários ligantes carregados.

Protocolo

1. Preparar as soluções para a análise ACE

1. Preparar a solução de NaOH 1 M.
   1. Pesar 4,0 g de NaOH num balão volumétrico de 100 ml.
   2. Encha-o até a marca com água deionizada para fazer um caldo de 1 M.
2. Preparar o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,1 M numa solução de NaOH 0,1 M.
   1. Transferir 10 ml de NaOH 0,1 M para um balão volumétrico de 100 ml, utilizando uma pipeta de 10 ml. Encha-o até a marca com água deionizada.
   2. Pesar 2,42 g de EDTA num recipiente de pesagem e dissolver o composto sólido nos 100 ml de NaOH 0,1 M.
3. Preparar a solução de tampão Tris (30 mM).
   1. Adicione 3,63 g de Tris, 200 mL de água deionizada e uma barra de agitação em um copo de 500 mL. Coloque o copo em uma placa de agitação e ligue-o.
   2. Coloque um eletrodo medidor de pH no béquer e ajuste o pH para 7,4 usando HCl 0,1 M.
   3. Encher a solução num balão volumétrico de 1 l e encher com água deionizada até ao traço.
      NOTA: Este procedimento tem de ser repetido ou é necessário um balão volumétrico maior, uma vez que é necessário mais de 1 L para toda a análise.
4. Preparar a solução de marcador de fluxo electroosmótico (EOF) de acetanilida (60 μM).
   1. Adicionar 6 mg de acetanilida e 100 ml de tampão Tris num balão volumétrico de 100 ml.
   2. Colocar o balão volumétrico num banho ultra-sónico e ligá-lo durante 30 minutos.
5. Preparar a solução de amostra (1 mg/ml).
   1. Coloque um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL em uma balança de precisão e adicione 0,3 mg de pó AtHIRD11 liofilizado no tubo.
   2. Use uma micropipeta para adicionar 0,3 mL de um tampão Tris de 30 mM (pH 7,4) no tubo. Agite o tubo cuidadosamente para dissolver a proteína.
6. Prepare as soluções de ligantes.
   1. Prepare a solução-mãe de CaCl₂ (5 mM).
      1. Pegue um barco de pesagem, coloque-o em uma balança analítica e pese 36,76 mg de CaCl₂ * H₂O.
      2. Com uma micropipeta, lavar o CaCl₂*H₂O do recipiente de pesagem para um balão volumétrico de 50 ml com o tampão Tris previamente preparado.
      3. Encher o balão volumétrico com o tampão Tris até ao traço.
   2. Preparar as restantes soluções-mãe (5 mM).
      1. Repita a etapa 1.6.1 usando os outros sais metálicos em vez de CaCl₂ * H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr (NO₃) ₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl₂ * 2H₂O: 41,47 mg, CuCl₂ * 2H₂O: 42,62 mg, ZnCl₂: 3,41 mg e NiCl₂ * 6H₂O: 59,43 mg].
         nota: A solução de ZnCl₂ tem uma concentração de 0,5 mM. Como foram observadas fortes interações entre os íons e a parede capilar interna, a concentração foi reduzida por um fator de 10⁴.
   3. Preparar a solução de CaCl_{500 μM 2}.
      1. Encher 10 ml da solução-mãe de CaCl₂ e colocá-los num balão volumétrico de 100 ml.
      2. Encher o balão volumétrico com um tampão Tris até ao traço e agitar o balão.
   4. Preparar a solução de CaCl₂₅₀ μM 2.
      1. Encher 5 ml da solução-mãe de CaCl₂ e colocá-los num balão volumétrico de 100 ml.
      2. Encher o balão volumétrico com um tampão Tris até ao traço e agitar o balão.
   5. Repita as etapas anteriores para as outras soluções de estoque.
7. Encha as soluções nos frascos.
   nota: Cada corrida repetida precisa de um conjunto de frascos de entrada e saída. O uso de novas soluções de ligantes na entrada e na saída reduz as mudanças no tempo de migração após cada execução.
   1. Encha a solução de CaCl₂₅₀ μM 2 em uma seringa de 10 mL.
   2. Coloque um filtro de PVDF de 0,22 μm na seringa e empurre 2 mL da solução através do filtro usando a seringa para descartar esta solução filtrada.
   3. Encha 10 frascos para injetáveis até ao volume máximo permitido com a solução de CaCl₂₅₀ 2 de 250 μM restante da seringa. Marque cada um como frasco de entrada de solução de CaCl₂₅₀ μM 2
   .
   4. Encha 10 frascos para injetáveis até que estejam cheios até a metade com a solução de CaCl₂₅₀ μM 2. Marque cada um como frasco de saída de solução de CaCl₂₅₀ μM 2.
   5. Repita as etapas 1.7.1 - 1.7.4 para as outras soluções contendo sais metálicos.
   6. Repita as etapas para cada par de frascos de entrada e saída usando a solução de tampão Tris 30 mM (pH 7,4).
      nota: O tampão Tris de 30 mmol / L pH 7,4 é usado entre as corridas para obter dados de tempo de migração para a proteína na ausência de íons metálicos. É necessário negligenciar as mudanças no EOF.
   7. Repita os passos acima para um frasco para injetáveis utilizando a solução de marcador de acetanilida (60 μM). Além disso, repita essas etapas usando a solução de amostra (1 mg / mL).

2. Análise eletroforética capilar de afinidade

1. Condicione o capilar
   1. Ajuste o termostato para 23 °C.
      nota: A temperatura é usada de acordo com os protocolos publicados e pode ser alterada para outras temperaturas. No entanto, as interações dependem da temperatura e mudarão de acordo.
   2. Lave um capilar por 40 min a 2,5 bar com NaOH 0,1 M.
   3. Lave o capilar por 10 min a 1,0 bar com água deionizada.
   4. Lave o capilar por 30 min a 1,0 bar com um tampão Tris de 30 mM (pH 7,4).
2. Preparação para os métodos ACE
   1. Prepare o método para as medições sem ligantes.
      nota: A acetanilida não foi adicionada à solução da amostra, pois disfarça 2 picos de proteína.
      1. Enxágue o capilar por 1 min a 2,5 bar com uma solução de EDTA 0,1 M.
      2. Enxágue o capilar por 1 min a 2,5 bar com água deionizada.
      3. Enxágue o capilar por 1,5 min a 2,5 bar com um tampão Tris para equilíbrio.
      4. Injete a solução de acetanilida por 6 s a 0,05 bar e troque os frascos de entrada e saída pelos frascos tampão Tris.
      5. Aplique 0,05 bar por 2,4 s para empurrar a solução de acetanilida da ponta do capilar mais para dentro.
      6. Aplique 10,0 kV por 6 min e detecte o pico de acetanilida em um comprimento de onda de 200 nm.
      7. Repetir os passos 2.2.1.1 - 2.2.1.6 utilizando a amostra de proteínas em vez da solução de acetanilida e detectar todos os picos de proteína.
   2. Prepare o método para as medições com ligantes.
      1. Enxágue o capilar por 1 min a 2,5 bar com uma solução de EDTA 0,1 M.
      2. Enxágue o capilar por 1 min a 2,5 bar com água deionizada.
      3. Enxágue o capilar por 1,5 min a 2,5 bar com a solução de ligante para equilibrar.
      4. Injete a solução de acetanilida por 6 s a 0,05 bar e troque os frascos de entrada e saída pelos frascos tampão contendo ligante.
      5. Aplique 0,05 bar por 2,4 s para empurrar a solução de acetanilida da ponta do capilar mais para dentro.
      6. Aplique 10,0 kV por 6 min e detecte o pico de acetanilida em um comprimento de onda de 200 nm.
      7. Repita as etapas 2.2.2.1 - 2.2.2.6 usando a amostra de proteína em vez da solução de acetanilida e detecte todos os picos de proteína.
   3. Repita alternadamente as etapas 2.2.1 e 2.2.2 para calcular a mudança nas razões de tamanho de carga para as várias interações proteína-íon metal.
      1. Troque a solução proteica a cada 60 h por uma nova.
         nota: Neste ponto, o experimento pode ser pausado. Este procedimento é repetido pelo menos 10x para cada concentração dos ligantes, uma vez que o padrão de pico varia ligeiramente de corrida para corrida. Se a solução for utilizada durante mais de 60 h, as variações tornam-se demasiado grandes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Exemplo de AtHIRD11	Universidade de Shizuoka (Grupo Prof. M. Hara)		Proteína de desidrina de Arabidopsis thaliana expressa em Escherichia coli
Capilar de sílica recusado,	Polymicro Technologies (Phoenix, EUA)	Rolamento 106815-0017	TSP050375 Diâmetro interno de 50 μm, diâmetro externo de 363 μm, revestimento de poliimida
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Alemanha)		Instrumento de eletroforese capilar; Agilent 7100 CE pode ser usado em seu lugar
Pipeta de bulbo 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Alemanha)	24 338 14	Preparando a solução do ligante
Balão volumétrico Duran glas 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Alemanha)	24 671 1457	Preparando a solução de estoque de ligantes
Balão volumétrico Duran glas 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Alemanha)	24 671 1054	Preparando a solução de estoque de ligantes
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	397229-5G	Marcador de fluxo eletroosmótico
Cloreto de manganês (II)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	Rolamento 13217	ligante
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	Rolamento 431788-100G	Ingrediente de enxágue
Cloreto de bário	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	202738-5G	ligante
Cloreto de níquel (II) hexahidratado	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	654507-5G	ligante
Cloreto de selênio (IV)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	323527-10G	ligante
2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha)	252859-100G	Ingrediente tampão
Cloreto de zinco (II)	Merck Millipore ( Darmstadt, Alemanha)	1088160250	ligante
Nitrato de estrôncio	Merck Millipore ( Darmstadt, Alemanha)	1078720250	ligante
Cloreto de cálcio di-hidratado	Merck Millipore ( Darmstadt, Alemanha)	1371015000	ligante
Cloreto de cobre (II) di-hidratado	Riedel-de Haën (Seelze, Alemanha)	Rolamento 31286	ligante
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Alemanha)	G2070-91126	Pacotes de software para operar os instrumentos CE, adquirir dados e avaliá-los