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Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Rochester comitê dedicado ao uso ético de animais na pesquisa (UCAR). Técnicas de assepsia devem ser seguidas durante o protocolo. O uso de luvas estéreis e máscara é obrigatório.
Todos os equipamentos, materiais, produtos químicos e ferramentas que são usadas durante o protocolo são descritos na Tabela 1.
1. Preparação pré-cirúrgica
- Injetar camundongos por via subcutânea com buprenorfina (0.05mg/kg) 2 h antes da cirurgia, imediatamente após a cirurgia e depois a cada 3-5 h nas 24 h primeiro período pós-operatório.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, esponjas de gaze, e aplicadores com ponta de algodão por autoclave. Manter instrumentos cirúrgicos em etanol 70% durante a cirurgia e ar seco em gaze esterilizada direito antes de usar. Pulverizar a área de trabalho com álcool 70%.
- Anestesiar o rato com uma mistura de gás de 3% isofluorano-20% de oxigênio, usando um vaporizador anestésico. Ajustar a quantidade de oxigênio com o medidor de vazão. Testar o nível de anestesia com pés ou beliscar a cauda (que deveria ser indiferente). Manter o nível de anestesia com 2% (v / v) isofluorano.
- Aplicar lágrimas artificiais para os olhos do rato e tome cuidado para não danificar o olho durante o procedimento cirúrgico. Posicione o mouse em seu lado direito em uma posição lateral.
- Raspar a área do lado esquerdo entre o olho esquerdo e na base da orelha esquerda usando o clippers animal. Limpar a área pela alternância entre uma solução de betadine e etanol a 70%, utilizando aplicadores de algodão ponta e esfregar levemente a área. Repita conforme necessário.
- Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento ligado a uma sonda retal para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Introduzir a sonda retal, utilizando óleo mineral.
- Posicione o mouse em seu lado direito sob o microscópio e prenda com fita adesiva. Cortar uma janela em uma gaze e cubra área cirúrgica.
2. Procedimento cirúrgico e MCA Ligadura
- Faça uma incisão vertical entre o olho esquerdo e na base da orelha esquerda usando uma tesoura fina reta. Use hemostats curvas para manter a área de cirurgia aberta.
- Faça uma incisão horizontal sobre o músculo temporal usando uma tesoura primavera e ligeiramente separada do músculo temporal do crânio por lentamente puxando com fórceps.
- Fazer uma craniotomia pequena subtemporal na junção do arco zigomático e osso esquamosal usando uma agulha de 18G, mantendo o maxilar com uma pinça curva.
- Expor o MCA, removendo os pequenos pedaços de crânio com fórceps óssea. Do arco zigomático e conteúdo orbital não deve ser danificado durante este processo. Se a secagem excessiva de tecido ocorre durante este processo, aplique PBS estéril com ponta de algodão aplicadores.
- Ligadura da porção distal do MCA usando um cauterizador de pequenos vasos.
- Coloque o músculo temporal de volta para sua posição original e feche o local da incisão cirúrgica com nylon 5-0.
- Descontinuar a anestesia e remover a sonda retal. Injetar o mouse com uma 2 ª dose de buprenorfina (0.05mg/kg) por via subcutânea. Devolver o mouse para a gaiola que foi mantida a 37 ° C com um painel de aquecimento.
- Acompanhar de perto o mouse para os próximos 24 h para qualquer desconforto (diminuição do consumo de apetite / água, postura encurvada, respiração aumentada, pilo-erigido cabelo). Injetar o mouse com buprenorfina por via subcutânea a cada 3-5 h pós-operatório até 24h. Fornecer o mouse com gel de recuperação durante este período.
3. TTC Coloração e Determinação do Volume Sistólico
- Vinte e quatro horas após a cirurgia profundamente anestesiar o mouse, transcardially perfundir do mouse com um TTC 4% (w / v) em tampão fosfato salino (PBS) por 15 min e depois com uma solução de paraformaldeído a 4% por 10 min usando uma mini-bomba peristáltica de vazão média. Remover o cérebro e colocá-lo na solução de paraformaldeído 4% durante a noite.
- Posição do cérebro dentro do bloco de corte. Fatia do cérebro em fatias 1 mm de espessura, utilizando lâminas de barbear.
- Coloque as fatias ao lado de uma régua de escala milimétrica. Fotografar as fatias usando uma câmera digital conectada ao microscópio de dissecação.
- Calcular a área acidente vascular cerebral, subtraindo a área não-infartada do site ipsilateral da área total do site contralateral utilizando Software Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Calcular o volume de ejeção pelo empilhamento da área golpe de 22 fatias.
4. Instruções para usar o software Image J
- Abra o arquivo de imagem a ser analisada no software Image J, clicando no menu arquivo.
- Clique na guia "linha reta" no programa. Desenhar uma linha reta entre as duas margens na régua. Clique em 'analisar' menu e selecione "escala set '. Definir a distância conhecida como 1, unidade de comprimento como mm.
- Clique na guia 'círculo à mão livre ". Desenhar um círculo para delinear o hemisfério contralateral. Clique em 'analisar' menu e selecione "medida". A janela de cálculo irá aparecer mostrando a área do círculo desenhado.
- Desenhar outro círculo em torno da área do acidente vascular cerebral ipsilateral excluindo hemisfério (branco). Medir a área, como indicado no passo 4.3. O novo valor será adicionado à janela de cálculo. A diferença entre os valores 1 e 2 representa a área do infarto, que é indicado como A na fórmula abaixo.
- Calcular a área acidente vascular cerebral em cada fatia, repetindo os passos 4,2-4,4. Tome somatória da área curso calculado em cada fatia (ΣA n). Isso representa volume de curso o fato de saber que a espessura de cada fatia é de 1mm.
ΣA n x 1mm (espessura de cada fatia) = volume do curso
5. Resultados representativos:
Os infartos obtidos por ligadura MCA permanente no rato são principalmente cortical. No entanto, é possível obter lesões subcorticais se o MCA é ligada ao ramo proximal lenticulostriate. Os volumes de acidente vascular cerebral após MCA ligadura pode variar de 10 milímetros a 35mm ³ ³ 19, 23. O volume sistólico calculado com TTC coloração em Moyanova et al. 19 estão entre 10mm a ³ ³ 22 milímetros, enquanto os volumes de acidente vascular cerebral determinada a partir de imagens de ressonância magnética em Filiano et al 23 têm entre 20mm a ³ ³ 35mm. A possível razão para estas diferenças talvez a localização exata da ligadura e os diferentes métodos utilizados para medir os volumes de acidente vascular cerebral.
Na Figura 1, um manchado TTC cérebro 24 horas pós ligadura MCA permanente em um rato selvagem tipo C57/BL6 é mostrado. O site do curso é branco na aparência (Fig. 1A, B). Figura 1A e B ilustram o site infarto de diferentes ângulos. A Figura 2 mostra fatias 1 mm de espessura do cérebro TTC manchada acidente vascular cerebral no sentido antero-posterior (Fig. 2A-G). Volume de infarto foi calculada 24 horas pós-cirurgia. O volume do infarto é ~ ³ 23mm.
Figura 1. Representação do site acidente vascular cerebral. AB, TTC manchado imagens do cérebro inteiro, 24 h após a ligadura MCA. Área branca representa o infarto.
Figura 2. Resultados representativos. (A G>), as seções do cérebro TTC manchada 1mm, 24 h após Mcal. Fatias estão alinhados no sentido antero-posterior. Área branca representa o infarto.