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1. Preparação de amostras
- Colete tecidos de adenoma hipofisário (0,2 - 0,5 mg) do departamento de neurocirurgia. Congele imediatamente em nitrogênio líquido e depois transfira para -80 ° C para armazenamento.
- Adicione 2 mL de NaCl a 0,9% em água destilada deionizada (ddH2O). Use esta solução para lavar levemente o sangue da superfície do tecido (3x).
NOTE: ddH2O com uma condutividade de 18,2 MΩ/cm é usado em todo o protocolo. Parte do tecido pode ser perdido ao lavar o sangue da superfície de um tecido.
- Adicione um volume (10 mL; 4 ° C) da solução contendo ácido acético 2 M e 0,1% (v / v) de β-mercaptoetanol para cada 0,5 - 0,6 g de tecido, homogeneize (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10x) com um homogeneizador de tecido, sonique o homogeneizado por 20 s, liofilize e armazene a -80 ° C.
- Meça o teor de proteína das amostras liofilizadas e homogeneizadas usando o kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
nota: A quantificação do BCA não é uma quantificação absoluta, e o resultado medido será alterado com um técnico diferente e o agente experimental. Um padrão de amostra de concentração fixa deve ser usado para diferentes experimentos. Portanto, a quantidade final de carga de proteínas para cada gel 2D será determinada com a imagem de boa resolução corada com prata ou Coomassie nos experimentos pré-projetados.
- Adicionar cerca de 300 μg da amostra liofilizada homogeneizada a um volume (282 μL) de tampão extrator de proteínas (ureia 8 M e CHAPS a 4%), seguido de repouso durante 2 h, sonicação em banho-maria durante 5 min, rotação durante 1 h, nova sonicação em banho-maria durante 5 min, rotação novamente durante 1 h, rotação e centrifugação a 15.000 x g por 20 min.
- Prepare as soluções-padrão BSA com as concentrações mencionadas: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 μg/mL com o padrão comercial BSA (2 mg/mL).
- Misture os reagentes BCA A e B (A:B = 50:1) como solução de trabalho BCA antes de usar.
- Adicione 0,1 mL da amostra ou da solução padrão a 2 mL de solução de trabalho de BCA em um tubo de microcentrífuga, seguido de mistura e incubação a 37 ° C por 30 min. Por fim, arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min e medir um valor de diâmetro externo de562 nm.
- Calcular a linha linear padrão (concentração de A562 nm vs. BSA) para obter uma equação de regressão para calcular o teor de proteínas da amostra com um valor de Ade 562 nm.
- Use 150 μg da amostra liofilizada equivalente de proteína para coloração de prata, ou 500 μg de proteína para coloração de Coomassie, para uma tira de gradiente de pH imobilizado (IPG) de 18 cm pH 3-10 não linear (NL).
nota: A tira seca IPG tem 0,5 mm de espessura e 3 mm de largura, com diferentes comprimentos, incluindo 7, 11, 13, 18 e 24 cm, e diferentes faixas de pH, incluindo pH 4-5, 4-7, 6-9 e 3-10 em um gradiente de pH linear ou não linear. O buffer IPG usado deve caber na faixa.
- Adicione 250 μL de tampão de extração (ureia 7 M, tioureia 2 M, CHAPS 4% (p / v), DTT 100 mM (adicionar antes do uso), 0,5% v / v de pharmalyte (adicionar antes do uso) e um traço de azul de bromofenol).
- Mantenha a solução abaixo de 30 °C, seguida de vórtice por 5 min, sonicação por 5 min e rotação por 50 min.
- Adicione 110 μL de tampão de reidratação (ureia 7 M, tioureia 2 M, CHAPS 4% (p / v), DTT 60 mM (adicionar antes do uso), tampão IPG 0.5% v / v (adicionar antes do uso) e um traço de azul de bromofenol). Sonicar por 5 min. Em seguida, gire a amostra por 50 min, vórtice por 5 min e centrifugue por 20 min a 15.000 x g.
- Colete o sobrenadante (350 μL) como solução de amostra de proteína.
2. Eletroforese em Gel Bidimensional
- IEF (Primeira dimensão): Execute o IEF no sistema de focagem isoeléctrica conforme descrito abaixo.
- Adicionar 350 μL da solução da amostra de proteínas na ranhura de um suporte de tiras IPG de 18 cm.
- Coloque uma tira de IPG de 18 cm com o lado do gel voltado para baixo na solução de amostra de proteína (evite bolhas).
- Adicione 3-4 mL de óleo mineral para cobrir a tira de IPG.
- Monte o suporte da tira IPG no sistema de foco isoelétrico com a extremidade pontiaguda na placa traseira (+) e a extremidade quadrada na placa frontal (-).
- Reidrate durante a noite (~ 18 h à temperatura ambiente).
- Defina os parâmetros IEF: corrente máxima de 30 μA por tira, 20 °C; 250 V, 1 h, 125 Vh, passo e retenção; 1.000 V, 1 h, 500 Vh, gradiente; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, gradiente; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, passo e retenção; e 500 V, 0,5 h, 250 Vh, passo e retenção. Deixe-o funcionar até um tempo total de 7,5 h e 36.875 Vh.
- Após o IEF, retire cada tira de IPG e remova o óleo mineral extra com uma toalha de papel insolúvel. Agora embrulhe a tira em uma folha de filme plástico e armazene a -80 ° C.
nota: O suporte da tira IPG deve ser limpo com a solução de limpeza do suporte da tira IPG e água destilada.
- SDS-PAGE (segunda dimensão): Execute SDS-PAGE em um sistema de eletroforese de células verticais
nota: Cada tamanho de gel SDS-PAGE deve ser de 255 x 190 x 1 mm.
- Use um rodízio multi-gel para lançar géis de resolução de 12% PAGE. Para fundir géis PAGE a 12%, execute as etapas a seguir.
- Adicione 270 mL de ddH2O, 150 mL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 180 mL de solução estoque de acrilamida / bisacrilamida a 40% (p / v) (29: 1, 40% p / v de acrilamida e 1,38% p / v N, N'-metilenobisacrilamida), 3 mL de persulfato de amônio a 10% e 150 μL de TEMED para fazer a solução de gel em um béquer. Misture delicadamente e evite bolhas.
- Despeje a solução de gel suavemente na câmara de multifundição até a altura de gel esperada (19 cm).
- Adicione imediatamente cerca de 3 mL ddH2O em cada gel de resolução para cobrir os géis. Deixe o gel polimerizar por cerca de 1 h.
- Prepare 20 L de tampão de eletroforese (25 mM Tris, 192 mM de glicerina e 0,1% de SDS). Encha o tanque tampão da unidade de separação de eletroforese com este tampão.
- Retire as tiras de IPG focadas do freezer e equilibre as tiras por 10 min, balançando suavemente em 4 mL de tampão de equilíbrio redutor (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M de ureia, 2% (p / v) SDS, 20% (v / v) glicerol, 2% p / v DTT (adicionar antes do uso) e um traço de azul de bromofenol).
- Equilibre por 10 min balançando suavemente as tiras de IPG reduzidas em 4 mL de tampão de equilíbrio de alquilação (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M de ureia, 2% (p / v) SDS, 20% (v / v) glicerol, 2,5% p / v iodoacetamida (adicionar antes do uso) e um traço de azul de bromofenol).
- Durante o equilíbrio do gel, desmonte a câmara de multifundição e retire o de gel de resolução preparado. Enxágue 3x com ddH2O. Remova o excesso de ddH2O com uma toalha de papel insolúvel e coloque em um suporte de gel.
- Enxágue as tiras de IPG equilibradas com tampão de eletroforese e remova o excesso de líquido da superfície da tira de IPG com a toalha de papel insolúvel.
- Coloque uma tira IPG no gel SDS-PAGE de resolução e deixe o lado plástico da tira IPG entrar em contato com a placa de vidro mais longa e a extremidade pontiaguda para a esquerda.
- Despeje 3-4 mL de agarose a 1% quente em tampão de eletroforese SDS (~ 80 ° C) rapidamente para selar a tira IPG na parte superior de cada gel SDS-PAGE e coloque a parte superior da tira IPG no topo da placa de vidro mais curta sem bolhas e, em seguida, polimerize por 10 min.
- Insira o de gel montado verticalmente entre as juntas de plástico no sistema de eletroforese vertical. Coloque a parte superior do gel com a tira IPG ao lado do cátodo (−).
- Ajuste o nível do tampão de eletroforese para imergir o de gel.
- Conecte e coloque a fonte de alimentação/unidade de controle no vol constantetage modo e opere a 200 V por cerca de 370 min enquanto monitora o corante.
- Após a execução, retire o de gel do sistema de eletroforese e remova suavemente o gel do de gel, evitando rasgar o gel, seguido pela coloração de proteínas separadas por 2DE.