Eletroforese em gel com zimografia: uma técnica eletroforética para detectar metaloproteinases da matriz avaliando a atividade enzimática

Resumo

Fonte: Hu, X. et al., Detecção de Metaloproteinases Funcionais da Matriz por Zimografia. J. Vis. Exp. (2010)

Este vídeo demonstra a técnica de eletroforese em gel de zimografia para avaliar a atividade das metaloproteinases da matriz (MMPs) presentes no sobrenadante da cultura de células. As MMPs ativas degradam o substrato específico da MMP incorporado em um gel de poliacrilamida, que aparece como faixas transparentes contra um fundo manchado escuro após a coloração.

Protocolo

1. Carregando e executando o gel

1. Todas as amostras devem ser preparadas de forma adequada para manter a função das enzimas e utilizadas imediatamente após a colheita ou armazenadas congeladas a -80 °C. As amostras não devem conter agentes redutores (como β-mercaptoetanol) nem ser fervidas antes do carregamento do gel.
2. Abra a bolsa contendo um gel dentro de um, enxágue o com água deionizada.
   1. Remova a fita protetora da parte inferior do e o pente da parte superior do gel.
   2. Enxágue os poços três vezes com tampão corrente (diluído a 1X em água deionizada).
   3. Coloque o gel na Mini-Cell, certificando-se de que o lado menor do esteja voltado para dentro. Trave no lugar com a cunha de tensão de gel. O Mini-Cell permite executar um ou dois géis em paralelo.
   4. Encha a câmara superior (interna) com 1X de buffer acima do nível dos poços, verifique se há vazamentos. Em caso de vazamentos, remova o tampão e reposicione o gel.
   5. Encha a câmara inferior com 1X buffer de corrida.
3. Carregue 10 μL de marcador molecular de proteína em um poço.
   1. Misture uma quantidade igual de tampão de carregamento de gel e de amostra e carregue nos poços do gel usando pontas de carregamento de gel (trocadas entre cada amostra). Esses poços podem ser carregados com até 20 μL no total.
4. Coloque a tampa na Mini-Cell e conecte os cabos do eletrodo à fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação e configure-a para funcionar em 125 V constantes por 90 minutos. Verifique a formação de pequenas bolhas no fio da câmara inferior, indicando circulação de corrente.
5. Ao executar seu primeiro gel, monitore o progresso da migração a cada 15 minutos, usando o azul de bromofenol incluído no buffer de carregamento como indicador. Deixe o gel escorrer até que o corante indicador atinja o fundo do gel.

2. Renaturalização e desenvolvimento do gel

1. Para cada gel, prepare 100 mL de tampão renaturante 1X e 200 mL de tampão desnaturante, ambos em água deionizada.
2. Quando o corante de rastreamento de azul de bromofenol atingir o fundo do gel, desligue a fonte de alimentação, abra o Mini-Cell e remova o gel. Separe os dois lados do usando a faca de gel (ou uma espátula de pesagem). Corte um canto para marcar a direção do gel.
3. Remova cuidadosamente o gel do e coloque em um recipiente com 100 mL de tampão de renaturação. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
4. Remova o tampão de renaturalização e adicione 100 mL de tampão revelador ao gel. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
5. Remova o tampão de revelação e adicione mais 100 mL de tampão de revelação ao gel. Incubar durante a noite (16-18 horas) a 37°C.
6. Remova o tampão de revelação e enxágue três vezes (5 minutos cada) com água deionizada sob agitação suave à temperatura ambiente.
7. Escaneie o gel para salvar o posicionamento exato das bandas padrão de proteína, pois elas se tornarão menos ou não visíveis após a coloração do gel.
8. Manchar o gel adicionando 20 mL de SimplyBlue Safestain ao gel. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente sob agitação suave.
9. Remova o SimplyBlue SafeStain e desmanche o gel em 100 mL ou mais de água deionizada por uma hora em temperatura ambiente sob agitação suave.
10. Para melhores resultados, substitua por água fresca deionizada e incube por mais uma hora ou mais em temperatura ambiente sob agitação suave.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aparelho de eletroforese Xcell SureLock Mini-Cell com marca CE	Invitrogen	EI0001
Fonte de alimentação (modelo 302)	VWR	Rolamento 93000-744
Géis de zimograma de gelatina Novex 10%, 1,0 mm, 12 poços	Invitrogen	EC61752BOX
Tampão de carregamento de gel Blue Juice	Invitrogen	10816015
Dicas de carregamento de gel	VWR	Rolamento 53509-015
Padrão de peso molecular da proteína	Invitrogen	LC5800
Tampão de corrida Novex Tris-Glicina-SDS	Invitrogen	LC2675
Tampão de renaturalização do zimograma Novex	Invitrogen	LC2670
Tampão de desenvolvimento de zimograma Novex	Invitrogen	LC2671
SafeStain SimplyBlue	Invitrogen	LC6060