Ensaio de Imunoesferas Multianalita: Uma Técnica de Imunoensaio Baseada em Fluxo para Detecção Simultânea de Vários Subtipos de Anticorpos em Amostra de Soro Humano

Resumo

Fonte: Fhied, C. L. et al., Monitoramento Dinâmico da Soroconversão usando um Ensaio de Imunoesferas Multianalitas para Covid-19. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo descreve uma técnica de imunoensaio usando esferas magnéticas fluorescentes ou microesferas acopladas a diferentes antígenos para detectar simultaneamente vários isotipos de anticorpos em uma amostra de soro. O ensaio é útil para entender a soroconversão durante uma infecção ou pós-vacinação.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação de microesferas conjugadas com antigénios

1. Selecione três frascos diferentes de microesferas magnéticas com regiões de esferas exclusivas, registrando o ID da esfera e as informações do lote para cada frasco usado.
   nota: As etapas a seguir serão seguidas para cada região distinta da microesfera. As microesferas são sensíveis à luz e devem ser protegidas da exposição prolongada à luz. Durante as etapas de lavagem, tome cuidado para não perturbar as microesferas. Se perturbado, permita uma segunda separação de 60 s.
2. Vortex o estoque de microesferas por 60 s e sonicar por 5 min antes de usar para dissociar grânulos agregados.
3. Transfira 1,0 x 10⁶ grânulos para tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,5 mL.
4. Insira o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 s. Com o tubo ainda no separador magnético, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o grânulo do grânulo.
5. Remova o tubo do separador magnético, ressuspenda os grânulos com 100 μL de água de grau HPLC e faça um vórtice por 30 s. Coloque o tubo de volta no separador magnético por 60 s e, em seguida, remova o sobrenadante. Repita este protocolo de lavagem duas vezes.
6. Remova o tubo do separador magnético e ressuspenda as microesferas lavadas em 90 μL de fosfato de sódio monobásico 100 mM, pH 6,2 (tampão de ativação) por vórtice por 30 s.
7. Adicione 10 μL de 50 mg / mL de Sulfo-NHS (diluído com tampão de ativação) às microesferas e vortex suavemente por 10 s. Adicione 10 μL de solução de EDC de 50 mg / mL (diluída com tampão de ativação) e vortex suavemente por 10 s. Incube microesferas por 20 min à temperatura ambiente (RT) com um vórtice suave a cada 10 min.
8. Repita as etapas de lavagem 1.4-1.5 com 50 mM MES, pH 5.0 (tampão de acoplamento) em vez de água de grau LC/MS para um total de duas lavagens.
9. Remova o tubo do separador magnético e ressuspenda os grânulos com 100 μL de tampão de acoplamento por vórtice por 30 s, seguido imediatamente pela adição da quantidade desejada de proteína.
10. Traga o volume total para 150 μL com o tampão de acoplamento. Misturar reação de acoplamento por vórtice por 30 s e incubar por 2 h por rotação em RT.
    nota: Para os ensaios aqui definidos, foram realizadas conjugações com as seguintes concentrações de proteínas: Spike S1: 5 μg; Nucleocapsídeo: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
11. Repita a etapa de lavagem 1.4 com solução salina tamponada com fosfato (PBS) - albumina de soro de cabra a 1%, 0.01% de polissorbato-20 (tampão de têmpera) em vez de água de grau LC / MS para um total de duas lavagens. Ressuspenda as microesferas lavadas em 100 μL de tampão de têmpera contendo 0,05% de azida de sódio por vórtice por 30 s.
    nota: Deixe os grânulos esfriarem completamente por pelo menos 6 h antes de prosseguir para qualquer outro procedimento.
12. Conte o número de microesferas recuperadas usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro. Registre a concentração observada no grânulo.
13. Refrigerar as microesferas acopladas a 4 °C no escuro.

2. Procedimentos

1. Desempenho do ensaio (protocolo base)
   1. Ressuspenda as microesferas acopladas por vórtice por 30 s e sonice por ~ 60-90 s.
   2. Remova a quantidade necessária de cada colóide de grânulo do respectivo tubo e combine os colóides de grânulo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Insira o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o grânulo do grânulo.
   4. Remova os grânulos do separador, ressuspenda-os com 100 μL de albumina de soro bovino PBS-1%, 0,01% de polissorbato-20 (tampão de ensaio) e vórtice por 30 s. Coloque o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 s. Repita este protocolo de lavagem (ou seja, etapas 2.1.3-2.1.4) duas vezes.
   5. Ajuste a concentração da mistura de microesferas de trabalho 3-plex adicionando um volume apropriado de tampão de ensaio para gerar uma concentração final de 100 microesferas por 1 μL para cada alvo.
   6. Alíquota de 12,5 μL da mistura de microesferas preparada na etapa 2.1.5 em cada alvéolo de uma placa de 384 poços ou 25 μL em cada alvéolo de uma placa de 96 poços.
   7. Dilua as amostras de plasma/soro 500 vezes em tampão de ensaio. Preparar amostras padrão de acordo com a titulação desejada.
   8. Adicione 12,5 μL de tampão de ensaio como a amostra em branco e adicione cada uma das amostras diluídas ou padrão em cada poço designado de uma placa de amostra de 384 poços ou 25 μL da amostra diluída em branco ou padrão em cada poço de uma placa de amostra de 96 poços.
   9. Cubra a placa com um selo ou folha de alumínio e incube por 1 h em RT em um agitador de placas ajustado para 700 rpm.
      nota: O esquema das curvas de diluição é apresentado no quadro 1.
   10. Preparar uma solução de anticorpos anti-detecção humana (soluções de anticorpos secundários) a 4 μg/ml com tampão de ensaio, conforme especificado no passo 2.1.11.
   11. Prepare IgM anti-humano de cabra, conjugado com IgA super brilhante 436 (SB) / IgA anti-cabra humana, Conjugado de ficoeritrina (PE) anticorpos de detecção a 4 μg / mL; ou IgM anti-humano de cabra, Conjugado SB / IgG anti-humano de cabra, anticorpos de detecção de conjugado PE a 4 μg / mL.
       nota: Para um formato de placa de 384 poços, são necessários 12,5 μL/poço da solução de anticorpo secundário preparada e, para um formato de placa de 96 poços, são necessários 25 μL/poço.
   12. Coloque a placa em um separador magnético, lave rapidamente e inverta com força sobre um recipiente de risco biológico para remover o líquido dos poços. Com a placa ainda invertida, bata com força na placa contra um maço grosso de papel.
   13. Lave cada poço com 100 μL de tampão de ensaio e remova o líquido por inversão forçada sobre um recipiente de risco biológico, conforme descrito anteriormente. Repita essas etapas (2.1.12-2.1.13) para um total de duas lavagens. Descarte todos os maços de papel usados em um recipiente de risco biológico.
   14. Adicione 12,5 μL da solução de trabalho de anticorpo secundário a cada poço de uma placa de 384 poços ou 25 μL a cada poço de uma placa de 96 poços. Cubra a placa com um selo ou folha de alumínio e incube por 30 min em RT em um agitador de placas ajustado para 700 rpm.
   15. Repita as etapas de lavagem 2.1.12-2.1.13.
   16. Adicione 75 μL de tampão de ensaio em cada poço de uma placa de 384 poços ou 100 μL em cada poço de uma placa de 96 poços. Cubra a placa com um selo ou folha de alumínio e incube por 5 min em RT em um agitador de placas ajustado para 700 rpm.
   17. Analise 60 μL através do analisador de instrumentos de acordo com o manual do sistema.

Tabela 1: Série de diluição para curvas padrão: Tabela de fatores de diluição usados para as curvas padrão para o sorotipo IgG; apresentado como uma curva de diluição serial de 7 pontos, 1:5, começando em 1 μg/mL para α-Spike S1 e α-Nucleocapsídeo e 5 μg/mL para anticorpos α-membrana.

Número padrão	Série de diluição	Anti-Spike S1 ou N (μg/mL)	Antimembrana (μg/mL)
em branco	em branco	-	-
1	STD7 1:1	1	5
algarismo	STD6 1:5	0,2	1
3	STD5 1:25	0,04	0,2
4	STD4 1:125	0,008	0,04
5	DST3 1:625	0,0016	0,008
6	STD2 1:3125	0.00032	0,0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de microtitulação de poliestireno de 384 poços com lado preto	Thermo Fisher	12-565-346
Tampão de ativação (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)	Preparado em casa
Tampão de ensaio (PBS, 1% de albumina de soro bovino, 0,01% de polissorbato-20)	Preparado em casa
Albumina de soro bovino, fração de choque térmico	MilliporeSigma	A-7888-50G
Tampão de acoplamento (50 mM MES, pH 5,0)	Preparado em casa
Proteína de matriz recombinante de coronavírus COVID 19 M (6xHistag)	MyBioSource	MBS8574735
Ponteiras de pipeta descartáveis
EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida)	Thermo Fisher	PIA35391
Albumina de cabra, pó de fração V	Millipore Sigma	A2514-1G
IgA Cabra anti-Humano, R-PE, Polyclona	Thermo Fisher	OB205009
IgG Cabra anti-Humano, R-PE, Policlonal	Thermo Fisher	OB204009
IgG Cabra anti-coelho, R-PE, policlonal	Thermo Fisher	OB403009
gM Cabra anti-Humano, R-PE, Policlonal	Thermo Fisher	OB202009
IgM Mouse anti-humano, SB 436, clone SA-DA4	Thermo Fisher	62999842
Analisador de Instrumentos	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
Tubos de microcentrífuga de baixa ligação (1,5 mL)	Thermo Fisher	Telefone: 13-698-794
Microesferas MagPlex-C, Região XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
Hidrato MES (hidrato de ácido sulfônico 2-(N-morfolino))	MilliporeSigma	M2933
Fita de vedação de alumínio para microplacas	Thermo Fisher	07-200-683
Polissorbato-20	Thermo Fisher	BP337-500
Qualidade Biológica Inc. PBS, pH 7,2	Thermo Fisher	Telefone: 50-751-7328
Tampão de têmpera (PBS, 1% de albumina de soro de cabra, 0,01% de polissorbato-20)	Preparado em casa
Proteína do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (tag Him)	Sino Biológicos	40588-V08B
Proteína Spike SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (Subunidade S1, tag Him)	Sino Biológicos	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Anticorpo, pAb de coelho	Sino Biológicos	40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo do Nucleocapsídeo, mAb de coelho	Sino Biológicos	40588-R0004
Anticorpo de membrana SARS-CoV-2 (COVID-19) (IN), pAb de coelho	ProSci	10-516
Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	Thermo Fisher	PIA39269
Tampão de lavagem (PBS, 0,01% polissorbato-20)	Preparado em casa
Água, grau LC/MS	Thermo Fisher	W-64