Ensaio de Atividade de Fosfolipase: Um Ensaio de Difusão em Gel para Determinar a Atividade da Fosfolipase em Extrato Bruto de Veneno de Anthopleura dowii

Resumo

Fonte: Ramírez-Carreto, S., et al., Identificação da Atividade Hemolítica e Fosfolipase em Extratos Brutos de Anêmonas do Mar por Bioensaios Simples. J. Vis. (2022)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para estabelecer a presença de fosfolipase no extrato bruto de veneno de Anthopleura dowii - uma anêmona marinha. O ensaio utiliza uma técnica de difusão em gel de agarose, na qual a enzima fosfolipase se difunde e decompõe os fosfolipídios incorporados no meio sólido de maneira radial.

Protocolo

1. Coleção de organismos

1. Colete anêmona-do-mar A. dowii.
   NOTA: Aqui, os organismos foram coletados durante os períodos de maré baixa na zona intertidal da costa de Ensenada Baja, Califórnia, México (Figura 1A, B). 
2. Transporte os organismos para o laboratório em recipientes com água do mar (Figura 1C).
3. No laboratório, limpe os organismos com água destilada à mão para remover as grandes partículas de substrato aderidas ao corpo.
4. Congelar imediatamente os organismos a -80 °C num ultracongelador durante 72 h.
5. Colocar os organismos em copos especiais para liofilização, com condições de liofilização de -20 °C, 0,015 psi, durante 48 h.
6. Conservar os organismos liofilizados a -20 °C até à utilização.

2. Hidratação tecidual

1. Reconstitua 20 g de peso seco de organismos liofilizados com 60 mL (1/3 p / v) de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5 e 1 comprimido de coquetel inibidor (Tabela de Materiais).
2. Em um agitador magnético, agite continuamente a amostra a ~ 800 rpm, 4 ° C, por 12 h.

3. Liberação de toxinas

1. Para induzir a lise celular e a descarga de nematocistos, congele a amostra a -20 °C por 12 h e, em seguida, coloque o recipiente em água à temperatura ambiente (RT) até descongelar até 90%. Repita este procedimento três vezes.
   nota: A amostra não descongela 100%; é crucial manter a amostra a ~ 4 ° C para evitar a degradação da proteína.
2. Observe o nematocisto descarregado sob um microscópio confocal. Pegue 10 μL da amostra em uma lâmina e coloque uma lamínula sobre ela. Observe sob um microscópio confocal com ampliação de 100x e 60x. Aqui um corante não era necessário.
3. Processe as imagens capturadas no microscópio confocal no software ImageJ (versão 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA, https://imagej.nih.gov/ij).
4. Se o túbulo dentro do nematocisto se desenrolar e estiver do lado de fora, os nematocistos são descarregados; então, continue com a próxima etapa. Caso contrário, conduza apenas mais um ciclo de congelamento e descongelamento.
5. Para clarificar o extracto, centrifugar a amostra a 25.400 x g durante 40 min, 4 °C, recuperar o sobrenadante e centrifugá-lo novamente. Repita esta etapa 3-4 vezes.
6. Recupere o sobrenadante e descarte o pellet. O extrato sobrenadante ou bruto contém os componentes do veneno (toxinas) e outras moléculas celulares, como lipídios, carboidratos e ácidos nucléicos.

4. Quantificação de proteína total

1. Determinar a concentração de proteínas do extracto bruto utilizando um kit comercial de ensaio colorimétrico Bradford (Tabela de Materiais).
2. Diluir o reagente do corante (uma parte do corante com quatro partes de água destilada).
3. Preparar a solução de albumina de soro bovino (BSA) Fração V (Tabela de Materiais) na concentração de 1 mg/ml em tampão fosfato (fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5).
4. Preparar as soluções enumeradas no quadro 1 em triplicado.
5. Misture vigorosamente cada solução em uma coqueteleira por 4 s.
6. Incubar as amostras durante 5 min em RT, sem agitar.
7. Medir a absorvância (AU) a 595 nm.
8. Plotar as médias das absorbâncias BSA da amostra (UA vs. concentração de proteína) e determinar a equação do gráfico (Equação 1).
   
   onde y é a absorbância, m é a inclinação da linha, x é a concentração de proteína e b é a interceptação y. Para calcular a concentração de extrato bruto, resolva o x da seguinte forma:
   

5. Determine a complexidade do veneno polipeptídico

1. Monte o recipiente de vidro para eletroforese em gel vertical de acordo com o manual.
2. Prepare a mistura de acrilamida (30%): 29,2 g de acrilamida, 0,8 g de bis-acrilamida, o volume final de 100 mL. Filtrar a solução com uma membrana de 0,45 μm. Conservar a solução num frasco escuro a 4 °C. Em seguida, prepare a mistura para o gel de resolução (Tabela 2).
3. O gel SDS-PAGE consiste em um gel de resolução e um gel de empilhamento. Prepare os géis de acordo com os volumes de solução definidos na Tabela 2. Durante a preparação, certifique-se de manter cada mistura a 4 °C para reduzir o tempo de polimerização.
   nota: O volume de cada mistura varia de acordo com a marca do equipamento utilizado; para este protocolo, os volumes correspondem à preparação de gel de acrilamida a 15%, com 0,75 mm de espessura, para uma câmara de eletroforese vertical (Tabela de Materiais).
4. Após a polimerização da acrilamida, ~ 10 min, adicione a mistura de gel de empilhamento.
5. Prepare a mistura para o gel de empilhamento, adicione-o imediatamente às placas de vidro e coloque um pente para formar os poços para carregar as amostras.
6. Assim que o gel de empilhamento polimerizar (~15 min), remova o pente e coloque o recipiente de vidro em uma câmara para eletroforese vertical.
7. Coloque 200 mL de tampão eletrodo (0,25 M Tris, 0,192 M glicina, 0,1% SDS) na câmara de eletroforese.
8. Analise o extrato bruto: Misture 30 μg de extrato bruto com 5 μL de tampão de carga de proteína (25% de glicerol, 15% de dodecil sulfato de sódio, 25% de 2-mercaptoetanol, 0,125 mM de Tris pH 7, azul de bromofenol 0,1 mg / mL) para desnaturar as proteínas. O volume final deve ser de <50 μL.
9. Aqueça a 90 °C por 5 min, resfrie e centrifugue por 3 s a 1.400 x g. 10. Carregue as amostras nos poços do gel de empilhamento. Carregue uma escada de peso molecular padrão.
10. Carregue as amostras nos poços do gel de empilhamento. Carregue uma escada de peso molecular padrão.
11. Execute a eletroforese a 25 mA constante por 1 h 30 min.
12. Remova os recipientes de vidro da câmara de eletroforese para prosseguir com a coloração das proteínas do gel.

6. Coloração de proteínas

1. Enxágue o gel em 50 mL de água destilada para remover os detritos do eletrodo tampão.
2. Descarte a água.
3. Para evitar a difusão das proteínas do gel, adicionar a solução de fixação (60 mL de etanol, 20 mL de ácido acético e 20 mL de água destilada, volume final de 100 mL). Incubar em RT por 40 min com agitação a 80 rpm. Transvase a solução.
4. Adicione a solução de reticulação de proteínas (15 mL de etanol, 0,25 mL de glutaraldeído, 50 mL de água destilada, volume final de 65,25 mL) e incube por 30 min em RT com agitação a 80 rpm. Remova a solução.
5. Lave o gel com 100 mL de água destilada por 5 min e retire a água. Repita este procedimento quatro vezes.
6. Realizar coloração proteica com 50 mL de solução filtrada Coomassie azul brilhante R-250 (40% de metanol, 10% de ácido acético, 50% de água destilada, 0,1% de corante, volume final de 100 mL), agitando a 60 rpm em um oscilador rotativo de laboratório em RT por 15 min.
7. Recupere a solução, que pode ser usada para manchar outros géis.
8. Para eliminar o excesso de corante, adicione uma solução descolorante (40 mL de metanol, 10 mL de ácido acético, 50 mL de água destilada). Continue mexendo (80 rpm) em RT até que as bandas (proteínas coradas) visualizem.
9. Mantenha o gel em 50 mL de água destilada e digitalize a imagem em um sistema de documentação de gel.

7. Ensaio de fosfolipase

1. Lave um ovo de galinha com 1% de SDS em água destilada.
2. Separe a gema da clara em condições estéreis.
3. Prepare 50 mL de solução de NaCl a 0,86% e filtre através de um filtro de 0,22 μm. Em seguida, prepare a Solução A: Adicione 12 mL de gema de ovo e 36 mL de solução de NaCl a 0,86%.
4. Prepare a solução B: Misture 300 mg de agarose em 50 mL de tampão (50 mM Tris, pH 7,5), filtre através de um filtro de 0,22 μm. Aqueça a solução no micro-ondas até ferver. Resfrie em água morna para atingir 43-45°C.
5. Prepare a Solução C: Prepare 10 mM CaCl2 e filtre-o com um filtro de 0,22 μm.
6. Prepare a Solução D: 10 mg de rodamina 6G em 1 mL de água destilada.
7. Em condições estéreis (capela de fluxo laminar), adicione 500 μL de soluções A e C à solução B e 100 μL de solução D, misture e despeje 25 mL em cada placa de Petri (90 x 15 mm).
8. Aguarde até que a solução solidifique em condições estéreis (30 min).
9. Faça poços (~ 2-3 mm de diâmetro) com um tubo fino.
10. Adicionar um total de 20 μL de tampão fosfato (controlo negativo) num alvéolo e 20 μL de uma determinada fosfolipase (controlo positivo) noutro poço.
11. Colocar diferentes quantidades da proteína do extracto bruto, 5, 15, 25, 35, 45 μg, nos restantes alvéois, cada uma num volume final de 20 μl.
12. Aguarde até que o ágar-ágar adsorva todas as amostras (30 min).
13. Incubar a 37 °C durante 20 h.
14. Se um halo se formar ao redor do poço, isso indica atividade da fosfolipase. Meça o halo formado com um paquímetro vernier.
    nota: Realizar a experiência em triplicata (passos de 7.1-7.14).

Resultados

Figura 1: Coleção de anêmonas-do-mar. (A) Zona entremarés em El Sauzal, Baja California Norte, México. (B) Anêmona-do-mar coletada. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869.

Tabela 1: Quantificação de proteína pelo ensaio de Bradford.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga cônico de 15 mL	Corning	430766
2-Azul de bromofenol	sigma	B75808
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL	Corning	430828
Ácido Acético Glacial	J.T. Padeiro	Rolamento 9515-03
acrilamida	Promega	V3115
agarose	Promega	V3125
Bisacrilamida	Promega	V3143
Soro Bovino Albumina Fração V	sigma	Rolamento A3059-100G
Ensaios de proteína de Bradford	Bio-Rad	5000006
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C3306
Placas de cultura de células 96 poços, fundo em V	Corning	3894
centrifuga	Eppendorf	5804R
Tubos de centrífuga	Corning	CLS430829
Sistema ChemiDoc MP	Bio-Rad	1708280
ácido cítrico	Sigma-Aldrich	251275
Placas planas transparentes de 96 poços	Thermo Científico	3855
Coomassie Azul Brilhante G-250	Bio-Rad	#1610406
Coomassie azul brilhante R-250	Bio-Rad	Rolamento 1610400
dextrose	J.T. Padeiro	1916-01
Gabinete sem dutos	Labconco	vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Bio Rad.		Sistema de Documentação de Gel
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516-4L
Hemocitômetro	Marienfeld	Nº 650030
ImageJ (Software)	NIH, EUA	Versão 1.53c
Incubadora 211	Contato Labnet	I5211 DS
metanol	J.T. Padeiro	9049-03
Tetracélula mini-PROTÉICA	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Padeiro	3824-01
NaCl	J.T. Padeiro	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Padeiro	3818-05
Software de origem		Versão 9	Para projetar o gráfico com ajustes sigmoidais
Petrídish	falcão	351007
Kit Pipetman	Gilson	F167380
Mini gel pré-fabricado	BioRad	1658004
Escada de Proteína Prestained	Thermo Científico	Rolamento 26620
Coquetel de inibidores de protease	Roche	11836153001
Concentrado de reagente de corante de ensaio de proteína	Bio-Rad	5000006
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	252433
Sds	Sigma-Aldrich	L4509
Citrato de sódio di-hidratado	JT Baker	Rolamento 3646-01
espectrofotômetro	THERMO CIENTÍFICO	G10S UV-VIS
Base Tris	Sigma-Aldrich	77-86-1
Fonte de alimentação Volt	Hoefer	PS300B