1. Fabricação de selos de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Desenhe uma matriz de anéis em microescala usando um software CAD, com um diâmetro interno de 250 μm e um diâmetro externo de 450 μm. O padrão usado neste protocolo é uma matriz de 10 x 10 com uma distância de 850 μm entre os anéis.
- Imprima uma máscara de transparência do padrão na resolução desejada usando o serviço de impressão de máscaras de uma empresa de microfabricação (consulte a Tabela de Materiais).
nota: As dimensões fornecidas do anel comprovadamente funcionam para muitos tipos de células.
- Realize fotolitografia ultravioleta (UV) usando a máscara contendo os recursos desejados para fazer um molde fotorresistente negativo (como SU-8).
- Cubra um wafer de silício revestido com fotorresistente pela máscara de transparência fabricada nas etapas 1.1-1.2.
- Em um alinhador de contato UV, polimerize o fotorresistente sob regiões transparentes da máscara por luz UV.
nota: Após mais lavagem e desenvolvimento, o molde mestre com as características desejadas é fabricado. Os detalhes operacionais dependem do equipamento específico usado.
- Prepare os pré-polímeros elastoméricos PDMS misturando com seu agente de cura na proporção de 10:1 e, em seguida, lance a mistura no molde em uma placa de Petri.
- Coloque o prato em uma câmara de vácuo por 30 min para remover bolhas de ar em PDMS e leve ao forno a 60 °C por pelo menos 2 h.
- Após a cura completa do PDMS, corte as matrizes de padrões em carimbos.
nota: Carimbos mais grossos (cerca de 1 cm) podem ser preferidos devido à facilidade de manuseio nas etapas posteriores da impressão por microcontato.
2. Revestimento de lâminas de vidro
- Limpe as lâminas de vidro. Mergulhe as lâminas em um banho de etanol 100%, sonice por 5 min e depois enxágue com água.
- Repita esta etapa primeiro com acetona, depois com isopropanol, seguido de secagem em um jato de nitrogênio.
- Use um equipamento de evaporação por feixe de elétrons (E-beam) para revestir camadas de titânio e ouro em lâminas de vidro.
nota: Para a camada de titânio, a espessura desejada é de 15 Å (1 Å = 10-10 m). Para a camada de ouro, a espessura desejada é de 150 Å. Cubra primeiro o titânio e depois o ouro, pois a camada de titânio serve como adesivo entre o ouro e a lâmina de vidro.
- Coloque as lâminas limpas na câmara de evaporação e insira cadinhos de ouro e titânio sob as venezianas.
- Bombeie a câmara para criar um vácuo inferior a 10-5 Pa antes de derreter os metais. Concentre o feixe de elétrons no metal e ajuste a potência para que a taxa de depósito seja apropriada para controlar a espessura de deposição.
- Abra o obturador para iniciar a deposição de metal. Feche o obturador quando a espessura desejada for atingida.
- Alterne os cadinhos entre a evaporação sequencial de dois metais.
- Aguarde até que os cadinhos esfriem conforme exigido pelo equipamento, ventile a câmara e retire as lâminas de vidro revestidas de ouro.
- Bombeie novamente a câmara para manutenção do equipamento.
nota: Os detalhes operacionais podem depender de um evaporador de feixe E específico. Ter uma baixa taxa de depósito de titânio bem controlada é importante. Uma espessa camada de titânio geralmente leva a pouca visibilidade, especialmente para imagens de fluorescência das células. Após o revestimento, as lâminas de vidro revestidas de titânio/ouro podem ser armazenadas em uma câmara de vácuo seca em temperatura ambiente por pelo menos 1 mês.
3. Impressão de microcontato
- Corte a lâmina revestida de titânio/ouro em pedaços menores, se desejar. Uma forma quadrada de 12 mm x 12 mm é recomendada para uma aplicação típica (Figura 1B).
- Use um cortador de vidro para deslizar pela superfície para deixar um rastro amassado, depois segure a lâmina de vidro em ambos os lados e dobre o amassado para quebrar em pequenos quartos. Evite tocar na superfície revestida com ouro.
nota: Para determinar visualmente qual lado do vidro é a superfície revestida em caso de tombamento acidental, compare o reflexo da luz em ambos os lados. A superfície revestida de ouro mostrará um reflexo mais brilhante, enquanto o lado não revestido terá um reflexo mais escuro (da camada de titânio do outro lado do vidro). Uma maneira alternativa é observar as bordas da corrediça, e o lado do revestimento pode ser determinado a partir da superfície de corte vertical.
- Limpe as lâminas embebendo em etanol 100% em uma placa de Petri com o lado dourado voltado para cima em um agitador orbital por pelo menos 10 min. Aspire o etanol e seque cada lâmina soprando com um jato de nitrogênio.
- Limpe os selos PDMS com água e sabão e depois etanol 100%. Seque os selos com gás nitrogênio.
- Preparar solução de octadecanetiol (C18) 2 mM dissolvendo 5,74 mg de pó de C18 em 10 mL de etanol a 100%
nota: Sele e armazene a solução de C18 à temperatura ambiente. Os padrões de impressão com C18 criam uma monocamada adesiva auto-montada para a qual a fibronectina e as células se ligam preferencialmente.
- Mergulhe os carimbos PDMS em solução C18 com a superfície padronizada voltada para baixo por 10 s e seque suavemente com gás nitrogênio por 60 s.
nota: Ao secar, coloque o jato longe do selo primeiro (cerca de 1 m) até que a maior parte do líquido e, em seguida, aproxime lentamente o jato para secar completamente o selo. Isso é para evitar que a solução C18 seja soprada em vez de secar no selo.
- Coloque o carimbo virado para baixo nas lâminas de ouro por 60 s antes de removê-lo.
- Para garantir a estampagem adequada, bata suavemente com a pinça nos carimbos para transferir corretamente os padrões. Não empurre com muita força, e o peso da pinça normalmente é suficiente.
nota: A inspeção visual do carimbo durante a rosqueamento garantirá que o carimbo e a lâmina de vidro tenham feito contato uniformemente.
- Prepare câmaras de umidade.
- Pipetar 1 mL de etanol a 70% para uma tampa de placa de Petri invertida e colocar um pedaço de parafilme para cobrir a superfície (coberta com a face voltada para cima).
- Use uma pinça para levantar, coloque o parafilme para garantir que não haja bolhas de ar e remova o excesso de etanol, se necessário.
- Prepare a solução 2 mM HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3): Dilua 5 μL de solução-mãe em 5 mL de etanol a 100%.
nota: A solução diluída de EG3 pode ser selada e armazenada a 4 °C, e o estoque de EG3 não diluído deve ser armazenado a -20 °C. O tratamento EG3 é usado para tornar a região vítrea sem C18 não adesiva às células.
- Micropipeta gotículas de 40 μL de EG3 para cada quarto de vidro deslizam para o parafilme na câmara de umidade, deixando espaço suficiente entre as gotículas para explicar o espaçamento das lâminas de ouro.
- Use uma pinça para colocar as lâminas de ouro impressas em C18 com a face voltada para baixo nas gotículas e certifique-se de que não haja bolhas sob as lâminas. Empurre suavemente as lâminas juntas sem levantá-las para minimizar a evaporação.
nota: Coloque uma borda das lâminas de vidro perto da gota e, em seguida, abaixe lentamente a outra extremidade da lâmina de vidro para baixo. Se uma bolha estiver presente, empurre a lâmina de ouro sem levantá-la até que a bolha não esteja mais presente.
- Feche bem a placa de Petri com parafilme e deixe-a em temperatura ambiente por pelo menos 3 h.
nota: Se desejar uma incubação extensa, sele duas vezes a placa de Petri e deixe-a por até 24 h.
- Em um armário de biossegurança, coloque as lâminas de ouro voltadas para cima em uma placa de Petri, mergulhe e enxágue 3 vezes em etanol a 70% para remover EG3 e, em seguida, deixe em etanol por 10 min para esterilização.
- Aspirar o etanol e substituí-lo por PBS estéril.
- Preparar outra câmara de humidade conforme descrito no passo 3.9, com PBS em vez de etanol.
nota: Devido à diferença na tensão superficial, é mais fácil adicionar primeiro 4-5 mL de PBS para aplicar o parafilme e remover as bolhas e, em seguida, aspirar o excesso.
- Prepare a solução de fibronectina de 50 μg/mL (outras proteínas, se desejado) em PBS estéril e micropipete gotículas de 50 μL de solução de fibronectina para cada quarto deslize sobre o parafilme, deixando algum espaço entre as gotículas.
nota: O revestimento de fibronectina facilita a adesão celular a superfícies padronizadas.
- Use uma pinça de wafer para colocar as lâminas voltadas para baixo nas gotículas e certifique-se de que não haja bolhas sob as lâminas. Empurre suavemente as lâminas juntas sem levantá-las.
nota: Pinças de lâmina de vidro ou pinças de wafer com pontas largas retas são recomendadas para manusear as lâminas.
- Deixe a placa de Petri na cabine de biossegurança por 30 min.
- Após 30 min, coloque as lâminas de ouro voltadas para cima no PBS após enxaguar por 3 vezes.
nota: As lâminas com padrão de fibronectina podem ser armazenadas em PBS a 4 °C por cerca de um mês.
4. Semeando células em lâminas micropadronizadas
- Aquecer os meios de cultura celular e a tripsina em banho-maria a 37 °C.
nota: A descrição a seguir da subcultura é para células NIH / 3T3. As condições de cultura podem variar dependendo dos tipos de células.
- (Opcional) Mergulhe as lâminas padronizadas em meios de cultura em uma placa de 12 poços, aqueça até 37 ° C em uma incubadora antes da tripsinização das células para melhor fixação celular.
- Tripsinizar as células, neutralizar com meio contendo FBS, centrifugar a 100 x g por 3 min e, em seguida, ressuspender misturando bem com meio fresco.
nota: Certifique-se de que as células estejam totalmente dissociadas umas das outras.
- Conte as células, dilua para 200.000 células/mL e adicione 0,5 mL da suspensão celular a cada poço contendo uma lâmina de ouro.
- Agite suavemente a placa do poço algumas vezes para uma semeadura uniforme das células e guarde-a em uma incubadora por 15 minutos para permitir a fixação das células.
- Após 15 min, verifique a fixação da célula ao microscópio. Aguarde mais tempo, se necessário.
nota: As células anexadas se espalharão na superfície com filopódio visível ou achatamento e não se moverão da superfície quando a placa do poço for suavemente batida ou movida.
- Aspire o meio contendo células soltas de cada poço e adicione 1 mL de meio de cultura. Para o tratamento medicamentoso, suplemente reagentes adicionais aos meios de cultura nesta etapa.
- Cultive as células na incubadora por 24 h e verifique a confluência para determinar se a quiralidade se formou.
nota: Acima de 75% de confluência é recomendado para a maioria dos tipos de células, e a superconfluência pode afetar a caracterização da quiralidade.
5. Coleta de imagens
- Fixe as células na confluência.
- Remova o meio de cultura da placa do poço e enxágue uma vez com PBS.
- Adicione a solução de paraformaldeído a 4%, incube em temperatura ambiente por 15 min e depois enxágue 3 vezes com PBS.
NOTA: Se a fixação alterar significativamente a morfologia celular, recomenda-se a obtenção de imagens antes da fixação
- Use um microscópio de contraste de fase com funcionalidade de câmera, imagem de cada anel nas lâminas em alta resolução (lente de objeto de 10x é suficiente para análise).
6. Caracterização da quiralidade celular (Figura 2)
- Baixe arquivos de código MATLAB para caracterização de quiralidade.
- Adicione a pasta de código e as subpastas (com a caixa de ferramentas de estatísticas circulares dentro) ao caminho do MATLAB e abra o arquivo "ROI_selection.m". Na linha 4, altere o diretório para a pasta de dados desejada (para usuários do Windows, mude "/" para "\" nas linhas 4 e 5).
- Altere o tamanho da imagem na linha 14, com as duas primeiras figuras representando o tamanho do círculo interno do anel, enquanto as outras duas representam o externo.
nota: Certifique-se de que os tamanhos de todas as imagens em uma pasta a ser analisada sejam idênticos.
- Clique no botão Executar para executar o código MATLAB "ROI_selection.m" para determinar a região de interesse (ROI) em imagens de contraste de fase.
- Arraste manualmente o quadrado de seleção para caber no anel e clique duas vezes na imagem para confirmar a seleção.
- Repita esta etapa para cada imagem na pasta (a próxima imagem aparecerá automaticamente após confirmar a seleção de ROI de uma imagem anterior); um arquivo ".mat" será gerado para armazenar as informações de ROI para cada imagem.
- Abra o arquivo "Analysis_batch.m" e altere o diretório da pasta da mesma forma que o passo 6.2. (Para usuários do Windows, para o primeiro uso, mude "/" para "\" nas linhas 5, 6, 124 e 130)
- Clique no botão Executar para executar o código "Analysis_batch.m" para determinar a quiralidade de vários padrões de anéis celulares. Um arquivo "datatoexcel.txt" será gerado, contendo estatísticas circulares para cada anel, bem como os números de anéis no sentido horário, não quiral e anti-horário.
