Ensaio de captação de vesículas extracelulares: um método para visualizar e quantificar a captação celular de vesículas extracelulares usando a técnica de imagem de fluorescência 3D

Resumo

Fonte: Kim, C. J., et al., Ensaio de captação de vesícula extracelular via análise de imagem de microscópio confocal. J. Vis. Exp. (2022).

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para visualizar e quantificar a captação celular de vesículas extracelulares ou EVs. Este ensaio utiliza imagens fluorescentes 3D usando um microscópio confocal e permite distinguir EVs internalizados daqueles aderidos à superfície celular.

Protocolo

1. Isolamento EV e marcação EV imunofluorescente no chip

1. Coleta de meios de cultura celular (CCM) e pré-processamento de CCM para isolamento EV
   1. Semear células PC3 a 30% de confluência em um frasco de cultura de^{células 2} de 75 cm. Permite que as células de controle cresçam até 90% de confluência (~48 h) em meios padrão e suplementos específicos de linhagem celular.
      nota: Para evitar que os componentes contendo EV afetem a absorção celular (ou seja, soro bovino fetal), use meios e suplementos empobrecidos em exossomos.
   2. Colha o CCM.
   3. Centrifugue o CCM a 1000 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT) para granular quaisquer células soltas e grandes detritos colhidos com o meio. Transferir o sobrenadante para um novo tubo cónico.
   4. No novo tubo, centrifugue o sobrenadante a 10.000 x g por 20 min a 4 ° C para pellet detritos menores e corpos apoptóticos remanescentes no meio. Alguns EVs maiores irão pellet. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.
   5. Filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de membrana hidrofílica de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm.
      nota: Se não estiver processando imediatamente o CCM para isolamento EV, armazene o CCM pré-processado a -80 °C até que o isolamento seja realizado. Se congelado, limite os ciclos de congelamento e descongelamento a um.
2. Isolamento EV do CCM usando um dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração
   1. Se congelado, descongele completamente o CCM e o vórtice por 30 s antes da etapa 1.2.2.
   2. Injete 1 mL de CCM pré-processado (etapa 1.1) na câmara de amostra do dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração (consulte a Tabela de Materiais).
      nota: Siga o procedimento operacional padrão para o dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração.
   3. Gire a 3000 rpm por 10 min na máquina de fiar de bancada (consulte Tabela de Materiais) para operar o dispositivo microfluídico.
      nota: Se o CCM permanecer na câmara de amostra após a execução inicial, execute rotações adicionais até que todo o CCM tenha esvaziado da câmara de amostra.
   4. Remova o fluido da câmara de resíduos pipetando e repita as etapas 1.2.1, 1.2.2 e 1.2.3 duas vezes.
      nota: No total, 3 mL de CCM serão processados para isolamento EV.
   5. Injete 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na câmara de amostra para lavar os EVs isolados. Gire na máquina de fiar de bancada para operar o dispositivo microfluídico conforme mencionado na etapa 1.2.3. Localize os EVs puros na membrana do dispositivo.
      nota: A qualidade dos EVs isolados do dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração, especificamente, foi confirmada e comparada com o método convencional de UC por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscópio eletrônico de varredura (SEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia de iluminação estruturada, ensaio de imunoabsorção enzimática e PCR em tempo real na pesquisa anterior.
3. Marcação imunofluorescente de EV usando dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração (Figura 1)
   1. Selecione um anticorpo específico para EV de acordo com a finalidade do ensaio (consulte a Tabela de Materiais).
      nota: Certos anticorpos podem interferir nos locais de ligação do ligante específicos das vias de captação de EV (ou seja, endocitose).
   2. Injetar 1 μg/ml do anticorpo específico para EV no orifício de eluição do dispositivo contendo 100 μL de EVs isolados.
   3. Incubar durante 1 h no escuro à RT num agitador de placas para garantir a distribuição uniforme do anticorpo pela amostra.
   4. Prenda uma fita adesiva no orifício de eluição. Injete 1 mL de PBS na câmara de amostra para eliminar quaisquer anticorpos residuais.
   5. Gire o dispositivo a 3000 rpm até que a câmara de amostra esteja vazia. Remova qualquer fluido da câmara de resíduos por pipetagem. Injete 1 mL de PBS na câmara de amostra.
      nota: Os EVs marcados com fluorescência estarão localizados na câmara da membrana.
   6. Pipete os EVs marcados com fluorescência (Figura 2) da câmara de membrana para um tubo âmbar. Bloqueie da luz até o uso.

2. Incubação das células com EVs marcadas com fluorescência para o ensaio de captação de EV

1. Semeadura e cultura de células-alvo nas placas compatíveis com cultura de células.
   1. Semeie 1 x 10⁴ células PC3 na placa de microlâmina de 8 poços (9,4 x 10,7 mm para cada poço) com 0,2 mL de meio ou 4 x 10⁴ células PC3 em um prato de 35 mm com 1 mL de meio. Colocar as células numa placa compatível com cultura de células constituída por uma lamínula fina (espessura: 0,18 mm).
      nota: A lamínula fina minimiza a dispersão adversa da luz.
   2. Permitir que as células adiram durante a noite em condições ideais de cultura de células (37 °C, concentração de CO₂ de 5%, umidade de 90%).
   3. Lave as células aderidas duas vezes com meios empobrecidos em exossomos (descritos na etapa 1.1.1).
2. Incubação celular com EVs marcados com fluorescência.
   1. Meça a concentração de EVs marcados com fluorescência (etapa 1.3.5) por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA, Figura 3). Determine a concentração ideal de EVs marcados com fluorescência a serem adicionados às células cultivadas (etapa 2.1.2.).
   2. Diluir os EVs marcados com fluorescência com meios empobrecidos em exossomos para corresponder à concentração desejada medida na etapa 2.2.1. (ou seja, 7,80 x 10⁹ EVs (em valor NTA) em 200 μL de meios empobrecidos em exossomos.)
   3. Adicionar os EV diluídos (passo 2.2.2) às células-alvo aderidas preparadas em 2.1.2. Incubar pelo tempo experimental (ou seja, 4, 8 ou 12 h).
   4. Lave as células três vezes com meios livres de exossomos para remover quaisquer EVs não internalizados.
      nota: Opcional: As células podem ser fixadas após a lavagem.
   5. Marcar o citoplasma das células aderidas com 1 μg/ml de CMTMR ((5-(e-6)-((4-clorometil)benzoil)amino) tetrametilrodamina) (ver Tabela de Materiais) e incubar em condições ideais de cultura celular (37 °C, concentração de CO₂ a 5%, humidade a 90).
      nota: Os corantes da área celular devem fluorescer separadamente dos EVs marcados para ajudar a determinar a localização espacial (internalizada ou superficial) dos EVs enriquecidos durante o ensaio de captação de EV.
   6. Lave as células marcadas duas vezes com meios empobrecidos em exossomos para remover o corante residual. Adicione meios novos empobrecidos em exossomos às células em preparação para imagens confocais de células vivas.

3. Microscopia confocal

1. Para realizar imagens de células vivas, utilize uma incubadora no palco para manter as condições ideais de cultura de células (37 ° C, concentração de CO₂ de 5%, umidade de 90%).
2. Coloque as células preparadas na incubadora no palco.
3. Defina os parâmetros de imagem com base em amostras de controle.
   nota: As amostras de controle sugeridas incluem: Somente EVs marcados com fluorescência, células marcadas com fluorescência, EVs não marcados e células não marcadas.
4. Determine a profundidade das células-alvo e a faixa de tamanho de empilhamento na direção z para adquirir imagens confocais 3D.
   nota: A espessura de uma pilha Z é de 1 μm. A aquisição da imagem 3D confocal durou 2 min 34 s (cada aquisição de imagem do plano Z levou aproximadamente 8 s; um total de vinte imagens da pilha Z).
5. Defina a aquisição de imagem para várias imagens empilhadas em z de corante específico da célula (ou seja, vermelho) e corante específico de EV (ou seja, verde) simultaneamente (Figura 4 e Figura 5A).

4. Processamento de imagem

1. Utilize o software de processamento automático de imagem para analisar as imagens confocais brutas empilhadas em z e determinar a absorção de EV pelas células (consulte a Tabela de Materiais).
2. Defina parâmetros de limiar para o sinal fluorescente das células e corantes específicos para EV. Construa as superfícies virtuais das células (Figura 5A, B).
   1. Para construir as superfícies virtuais das células, clique no botão Adicionar novas superfícies.
   2. Selecione Cálculo de distância mais curta como "Configurações de algoritmo" para usar o algoritmo fornecido pelo software e clique em Avançar: Canal de origem.
   3. Selecione Canal 2 – CMTMR como "Canal de Origem" neste experimento.
   4. Selecione Suavizar e coloque o valor apropriado em "Detalhe de superfícies" para suavização de superfície.
      NOTA: 0,57 μm neste experimento, pois 1 pixel representa 0,57 μm em dados brutos de imagem.
   5. Selecione Intensidade absoluta como "Limiar".
   6. Para limitar automaticamente a imagem fluorescente pelo algoritmo fornecido, clique em Limite (Intensidade Absoluta): O valor é definido automaticamente.
   7. Selecione Ativar como "Dividir objetos em contato (região em crescimento)" e coloque o valor do tamanho estimado da célula em "Diâmetro dos pontos de semente", 10,0 μm neste experimento. Em seguida, clique em Avançar: Filtrar pontos de semente.
   8. Para configurar as superfícies de células virtuais, clique no botão + Adicionar e selecione Qualidade como "Tipo de filtro". Limite o valor apropriado (210 neste experimento) para o limite inferior por uma inspeção visual e o valor máximo (1485) para o limite superior e, em seguida, clique no botão Concluir.
      nota: Uma inspeção visual significa que um pesquisador pode discriminar a área celular de uma imagem fluorescente bruta.
   9. Em seguida, para construir os pontos virtuais de EVs, clique no botão Adicionar novos pontos.
   10. Selecione Diferentes tamanhos de ponto (região crescente) e Cálculo da distância mais curta como "Configurações do algoritmo" e clique em Avançar: Canal de origem.
   11. Selecione o Canal 1 - Alexa Fluor 488 como "Canal de origem" neste experimento.
   12. Coloque o valor apropriado em "Diâmetro XY estimado" para a detecção de pontos, 1 μm neste experimento. Em seguida, clique em Avançar: Filtrar pontos.
   13. Para configurar os pontos EV virtuais, clique no botão + Adicionar, selecione Qualidade como "Tipo de filtro" e defina "Limite inferior" por uma inspeção visual, 100 neste experimento. Em seguida, clique no botão Avançar: Tipo de região spot.
   14. Selecione Intensidade absoluta como "Tipo de regiões de spot" e clique em Próximo: Regiões de spot.
   15. Para limiar, a região dos pontos EV, coloque o valor apropriado em "Limite de Região" por uma inspeção visual, 100 como "Limite de Região" neste experimento.
       nota: Uma inspeção visual significa que um pesquisador pode discriminar a área de EVs de uma imagem fluorescente bruta.
   16. Selecione "Volume da região" como "Diâmetro de" e clique em Concluir.
3. Use os algoritmos fornecidos pelo software para dividir os pontos agrupados dentro da superfície construída na etapa 4.2 (Figura 5C, i-iv).
   1. Clique nos Spots construídos e vá para Filtros.
   2. Clique no botão + Adicionar e, em seguida, selecione Distância mais curta para superfícies Superfícies = Superfície 1 como Tipo de filtro e, em seguida, clique no botão Duplicar seleção para novos pontos. O limite mais baixo (-7,0 neste experimento) para o limite inferior e o valor apropriado (-0,5) para o limite superior.
      nota: Defina o limite superior com o raio estimado de Pontos. Neste experimento, o diâmetro estimado de Spots, ou seja, pontos EV, foi definido para 1 μm na etapa 4.2.11.; assim, o limite superior pode ser 0,5.
4. Contagem automática de EVs dentro das células
   nota: O software contará automaticamente o número de EVs dentro das células, indicando o número internalizado pelas células-alvo.
   1. Clique na seleção de Pontos 1 construídos [Distância mais curta para superfícies Superfícies = Superfícies 1 entre -7,00 e -0,500].
   2. Vá para as Estatísticas e exporte o valor de "Número Total de Vagas"
      nota: Os algoritmos fornecidos pelo software calcularão automaticamente o número e o volume das células.
5. Determine o rendimento da absorção de EV por período de incubação com base nos valores calculados acima (Figura 6).
   1. Para obter o número de células, clique em Superfícies 1 construídas, vá para Estatísticas e exporte o valor de "Número Total de Superfícies" de Geral.
   2. Vá para Detalhado em Estatísticas para exportar o Volume de Detalhado.

Resultados

Figura 1: Ilustração esquemática do isolamento EV e rotulagem no chip usando um dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração. (A) Isolamento EVs do CCM. (B) Marcação imunofluorescente no chip de EVs. (C) Remoção de anticorpos não ligados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-CD63 humano Alexa Fluor 488	Biolenda	353038	Anticorpo específico para EV conjugado com corante fluorescente
Corante CellTracker Laranja CMTMR	Thermo Fisher Científico	C2927	Reagente de marcação fluorescente de células vivas (citoplasma)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objetivo para imagem confocal, NA=1,25
Plano CFI Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objetivo para imagem confocal, NA=0,75
Exodisco	Labspinner Inc.	EX-D1001	Um dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração para isolamento EV
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Dispositivo de operação para Exodisc
FBS esgotado em exossomos	Thermo Fisher Científico	A2720801	Nutriente de meios de cultura celular para coleta de EV derivada de linhagem celular PC3
Soro fetal bovino (FBS)	VWR	1500-500	Nutriente para cultivo celular
IgG H&L anti-rato de cabra pré-adsorvido	abcam	AB7063	Anticorpo IgG de camundongo para controle negativo da marcação EV
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	Rolamento 81156	Placa de cultura para imagens confocais
Imaris 9.7.1	Instrumentos Oxford	9.7.1	Software de pós-processamento de imagem
Sistema de incubadora + misturador de gás CO2 / O2 / N2	Instrumento de célula viva	TU-O-20	Sistema de incubadora para imagens de células vivas
Câmera Nikon A1 HD25 / A1R HD25	Nikon	NA	Câmera para imagens confocais
Microscópio Nikon Eclipse Ti	Nikon	NA	Microscópio invertido para imagens confocais
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Software de processamento de imagem para microscópio Nikon
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Dispositivo de medição para concentração de EV
OriginPro 2020	Laboratório de Origem	9.7.0.185	Software gráfico
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Científico	15140122	Antibióticos para cultivo celular
RPMI 1640	Thermo Fisher Científico	21875034	Meios de cultura celular para cultivo de linhagem celular PC3
SYTO RNASelect Coloração de células fluorescentes verdes - solução de 5 mM em DMSO	Thermo Fisher Científico	S32703	Corante fluorescente de coloração de RNA para a rotulagem EV