O ensaio de captura de partículas semelhantes a vírus: um método para isolar VLPs exibindo antígenos de uma amostra usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos neutralizantes

Resumo

Fonte: Rosengarten, J. F., et al. Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura. J. Vis. Exp. (2022).

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de imunoprecipitação, chamado ensaio de captura de VLP, para isolar partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos, ou VLPs, de uma amostra. O antígeno se liga a anticorpos específicos ligados a esferas magnéticas, formando um complexo antígeno-anticorpo imobilizado que é posteriormente separado e armazenado para análise posterior.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Semeie as linhagens celulares em suspensão produtoras de VLP derivadas de células 293-F que expressam genes estruturais do HIV gag sozinhas ou em conjunto com env em uma baixa densidade celular de 0,5 x 10⁶ células por mL em meio de expressão 293-F.
2. Deixe-os expandir por 3-4 dias a 37 ° C e 8% de CO₂ em uma rotação da incubadora agitadora com uma órbita de 5 cm e 135 voltas por minuto (rpm).
3. Pulverizar as células produtoras por centrifugação a 100 x g durante 5 min. Filtrar o sobrenadante clarificado para remover as células residuais e os restos celulares utilizando filtros de seringa de membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm para obter o sobrenadante de cultura de células livres (CFSN).
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. O CFSN pode ser armazenado durante a noite a 4 °C.
4. Use o CFSN diretamente para o experimento ou VLPs de pellets de 35 mL de CFSN empregando ultracentrifugação (112.700 x g, 4 ° C, 1,5 h).
5. Após a ultracentrifugação, descartar o sobrenadante e suspender os pellets VLP em 200 μL de solução de trealose a 15% (p/v) por tubo de centrífuga.
   NOTA: O pellet VLP geralmente não é visível a olho nu. O protocolo pode ser pausado aqui. As VLPs podem ser armazenadas a –80 °C.
6. Antes do ensaio de captura de VLP, determine as concentrações de proteínas centrais virais nas amostras contendo VLP usando um ELISA. Esta etapa é importante para padronizar a entrada do ensaio de captura.

2. Ensaio de captura de VLP

NOTA: Uma visão geral do fluxo de trabalho é representada na Figura 1.

1. Suspenda os grânulos magnéticos pipetando para cima e para baixo ou misturando em um rotador a 50 rpm por pelo menos 5 min.
2. Enquanto isso, prepare a solução de anticorpos contendo os bNAbs. Use 10 μg de cada bNAb em 200 μL de tampão de ligação e lavagem de anticorpos (consulte a Tabela de Materiais) por reação.
   NOTA: As quantidades de anticorpos podem variar dependendo da afinidade do bNAb e da densidade de decoração do antígeno nas VLPs usadas.
3. Use 50 μL da solução de esferas magnéticas (consulte a Tabela de Materiais) por reação e transfira as esferas para um tubo de reação de 1,5 mL. Coloque os tubos no rack de separação magnética.
   NOTA: Alternativamente, um único ímã forte pode ser usado para cada tubo para separar as contas do sobrenadante.
4. Aguarde alguns minutos até que as contas se acumulem na parede do tubo para garantir que todas as contas sejam coletadas. Remova o sobrenadante.
5. Remover o íman e suspender os grânulos em 200 μl da solução de bNAb preparada no passo 2.2. Incubar durante 30 min a 3 h misturando num rotador a 50 rpm à temperatura ambiente.
6. Colocar novamente os tubos de reacção na grelha de separação magnética, aguardar e retirar o sobrenadante.
7. Remova os tubos do ímã e lave os grânulos ressuspendendo em 200 μL de ligação de anticorpos e tampão de lavagem.
8. Repita a etapa 2.4. Remova o máximo de tampão de lavagem possível.
9. Adicione as amostras ao arquivo bNAbs.
   NOTA: A entrada VLP para o ensaio de captura usando partículas derivadas do HIV deve ser de pelo menos 15 ng de proteína central viral por reação. As quantidades de VLP podem variar dependendo da afinidade do bNAb e da densidade de decoração do antígeno nas VLPs usadas.
10. Se o sample volume adicionado na etapa 2.9 estiver abaixo de 1 mL, adicione PBS para ajustar o sample volume para 1 mL. Suspenda as contas suavemente pipetando.
11. Incube as amostras e grânulos por 2,5 h em um rotador à temperatura ambiente. Certifique-se de que os grânulos permaneçam em suspensão e que a solução seja bem misturada durante a incubação.
12. Coloque os tubos no ímã e remova o sobrenadante.
13. Lave as esferas magnéticas suspendendo-as em 200 μL de tampão de lavagem (consulte a Tabela de Materiais). Repita a etapa de lavagem três vezes.
14. Suspenda os grânulos em 100 μL de tampão de lavagem e transfira a suspensão para um tubo de reação limpo (resistente ao calor).
15. Coloque o tubo no rack de separação magnética (consulte a Tabela de Materiais) e remova o sobrenadante completamente.
16. Prepare amostras SDS-PAGE desnaturadas seguindo as etapas 2.16.1-2.16.2 ou amostras não desnaturadas eluindo as VLPs das esferas magnéticas seguindo as etapas 2.16.3-2.16.5.
    1. Para preparar amostras SDS-PAGE desnaturadas, suspenda os grânulos em 20-80 μL de tampão Laemmli (0,8 μL de tampão Laemmli por 1 ng de entrada de ensaio p55 Gag) e incube a 95 ° C por 5 min.
    2. Prossiga diretamente com SDS-PAGE ou armazene as amostras a -20 °C.
       CUIDADO: O tampão Laemmli contém 2-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio. Use luvas de proteção e proteção para os olhos. Evite o contato com a pele, olhos e roupas. Não inale vapores. Trabalhe em um espaço bem ventilado, por exemplo, uma hotte.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
    3. Alternativamente, execute uma etapa de eluição não desnaturante para obter VLPs com estrutura proteica nativa preservada.
    4. Adicione 25 μL de tampão de eluição (frequentemente fornecido com os grânulos) aos grânulos magnéticos e incube por 2-5 min em temperatura ambiente.
    5. Remova os grânulos e transfira o eluato para um tubo limpo. Utilizar o eluído para ensaios subsequentes ou armazená-lo a 4 °C.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

Resultados

Figura 1: Ilustração esquemática das principais etapas do ensaio de captura de VLP usando sobrenadantes livres de células. (1) O ensaio de captura de VLP começa com a ligação dos bNAbs do HIV-1 às esferas magnéticas acopladas à proteína G. Enquanto isso, a solução VLP com uma concentração definida de p55 é preparada. O sobrenadante de cultura livre de células consiste em uma mistura ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de reação de 1,5 mL	Eppendorf
10x PBS	gibco	70011044
Anticorpos (bnAbs)	Polymun Scientic
Dynabeads Proteína G Kit de imunoprecipitação	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	Inclui amortecedores e lavagem Soluções
Células FreeStyle 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	R790-07
FreeStyle 293 Expression Médio	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Rack de separação magnética	Biolabs da Nova Inglaterra	S1509S	para 12 tubos de 1,5 mL ou 6 tubos de 1,5 mL
Ultracentrífuga Optima XE-90	Beckman Coulter
Fluoreto de polivinilideno (PVDF) filtros de seringa, 0,45 μm	Carl Roth	KC89.1
de transferência em PVDFde membrana, 0,45 μm	Carl Roth	T830.1
Título rápido HIV p24 ELISA	Biolabs de células	VPK-108-H
Rotator	Heidolph	REAX2
Rotor SW28	Beckman Coulter
Termomisturador	Cel Mídia	básico
Trealose di-hidratada	Carl Roth	8897.2
Tubos de centrífuga ultra transparentes	Beckman Coulter	344058