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1. Novo design de câmara (Figura 1)
- Abra uma nova placa de analisador de células de câmara dupla. Separe a câmara superior com eletrodos.
- Usando uma fresadora, raspe 2 mm dos poços inferiores em forma de U da placa do analisador de células.
- Prenda uma membrana de polietersulfona (PES) de 2 cm x 7 cm com tamanho de poro de 0,2 μm no fundo dos poços raspados usando adesivo com curadoria de UV. Aguarde 30 minutos de tempo de curadoria para garantir que a cola esteja completamente curada e inerte.
- Usando uma fresadora, corte duas fendas longitudinais (1,5 mm x 5,6 mm) ao longo dos lados para encaixar nas cristas da terceira câmara recém-fabricada.
- Usando uma fresadora, crie uma terceira câmara de policarbonato que reproduza as dimensões gerais da placa do analisador de células; 72 mm x 18 mm (Tabela de Materiais).
- Crie poços de 4,8 mm de profundidade e 4,75 mm de diâmetro para replicar o design de 16 poços da placa do analisador de células. Isso permite 90 μL de volume por poço.
- Nas laterais, crie duas cristas triangulares para que a câmara trave nas fendas originais criadas na etapa 1.4. A parte horizontal do triângulo é de 1,5 mm, a vertical é de 1,4 mm e a hipotenusa é de 2,052 mm.
- Crie um botão no lado curto com 50,8 mm de diâmetro e 1,397 mm de altura para caber no entalhe da placa original (Figura 1, Meio).
- Use uma arruela de borracha de 0,9 mm de espessura para cada poço para fornecer um ajuste selado.
2. Cultura de células (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastos)
- Lave as culturas de células aderentes (~ 70% de confluência) com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Adicione solução de tripsina-EDTA a 0,05% para retirar as células.
- Neutralizar a solução de tripsina com meios de cultura de células contendo soro e contar as células com uma alíquota da suspensão celular.
nota: Os meios de cultura de células específicos podem ser encontrados na Tabela 1.
3. Dissociação do xenoenxerto derivado do paciente
- Pique um pedaço de tumor fresco (1 cm2) em mingau fino usando um bisturi estéril.
- Colocar em um tubo cônico de 50 mL com 20 mL de meio DMEM F12 suplementado com 3 mg/mL de tripsina e 2 mg/mL de colagenase.
- Incubar num agitador térmico (150 RPM) a 37°C durante 20 min.
- Girar o tubo a 500 x g durante 5 min; retirar o sobrenadante.
- Adicione 20 μL de DMEM F12 + 2% de FBS para lavar as células; gire a 300 x g por 5 min e remova o sobrenadante. Repita a lavagem mais duas vezes.
- Ressuspenda em 1 mL de meio PDX (Tabela 1) para contar as células.
4. Extração de células da medula óssea
- Lave o filtro de coleta de medula óssea (MO) com 25 mL de 1x PBS.
nota: Neste estudo, o PBS foi adicionado a um filtro de coleta de MO usado do hospital para coletar o MO restante no filtro.
- Adicione o MO lavado lentamente a um tubo cônico de 50 mL com 25 mL de meio gradiente de densidade, tomando cuidado para manter as camadas o mais separadas possível.
- Gire a 800 x g por 20 min a 18 °C.
- Extrair as camadas superiores após centrifugação (gordura/plasma) e transferir 5 mL da camada branca acima do meio de gradiente de densidade que contém as células MO para um tubo cônico de 15 mL.
nota: Como alternativa, mergulhe uma pipeta de 5 mL na camada superior até tocar a camada intermediária (BM) e pipete a camada intermediária muito lentamente, sem mover a pipeta.
- Encha o tubo cônico de 15 mL com 1x PBS (~ 10 mL) e gire a 300 x g por 15 min.
- Remova o sobrenadante; o grânulo branco restante é o BM.
- Se forem observados glóbulos vermelhos no pellet, adicione 5 mL de solução de lise de hemácias (Tabela de Materiais) e deixe descansar por 5 min em temperatura ambiente (TR). Gire a 300 x g por 5 min e remova o sobrenadante.
- Adicione 10 mL de 1x PBS para lavar as células, gire a 300 x g por 5 min e remova o sobrenadante. Repita a lise das hemácias (passo 4.7) até que o pellet fique branco.
5. Semeadura e montagem de células
- Coloque todas as três câmaras estéreis na capa de cultura de tecidos.
- Localize o botão no lado curto da câmara inferior. Oriente a câmara inferior de modo que o botão fique voltado para o experimentador.
- Adicione 30.000-50.000 células em 90 μL de meio a cada poço da câmara inferior. Evite formar bolhas. Estas são as células estromais que fornecerão fatores secretados, mas não serão detectadas pelos eletrodos da câmara superior.
- Use 5% de meio suplementado com soro fetal bovino em dois poços de câmara inferior como controle positivo para a motilidade celular. Use meio suplementado com soro 0% como controle negativo.
- Deixe a câmara inferior com as células descansar por 10-15 min no capô para assentar.
nota: Esta etapa é recomendada se as células estiverem aderentes ou crescerem em suspensão.
- Gire a câmara inferior a 90° e coloque a câmara do meio na parte superior de modo que o botão da câmara inferior deslize para dentro do entalhe da câmara do meio.
nota: O botão na câmara inferior e o ponto azul na câmara do meio estão em extremidades opostas do conjunto.
- Empurre verticalmente para baixo até ouvir um som de clique em cada um dos lados longos do conjunto.
- Adicione 160 μL de meio sem soro a todos os poços da câmara intermediária.
- Certifique-se de que um menisco em forma de cúpula esteja visível após o enchimento dos poços; caso contrário, ajuste o volume final com base na calibração da pipeta. Evite formar bolhas.
- Coloque a câmara superior com os eletrodos voltados para baixo na câmara do meio, certificando-se de alinhar os pontos azuis nas câmaras intermediária e superior.
- Empurre verticalmente para baixo até ouvir um som de clique em cada um dos lados longos do conjunto.
- Adicione 25-50 μL de meio sem soro à câmara superior.
- Monte o conjunto no analisador de células de dupla finalidade na incubadora de cultura de tecidos e aguarde 30 minutos antes de medir o fundo.
nota: Este tempo é necessário para equilibrar a matriz e pode ser usado para preparar as linhas celulares a serem adicionadas à câmara superior.
- Meça o fundo (consulte a seção 6) e coloque o conjunto de volta na capa de cultura de tecidos.
- Adicione 30.000-50.000 células em 100 μL de meio sem soro a cada poço da câmara superior. Estas são as células que o eletrodo detectará assim que migrarem com sucesso através da membrana
nota: Para obter a resposta máxima, recomenda-se o cultivo de células em meios sem soro ou com baixo teor de soro por 6-18 h antes de realizar o ensaio.
- Deixe o conjunto repousar no capô por 30 minutos antes de montar no analisador de células de dupla finalidade para medição de impedância.
6. Medição de fundo e impedância
- Coloque a matriz no berço do instrumento analisador de células de dupla finalidade.
- Abra o software do analisador de células e selecione o suporte a ser usado.
- Clique na guia Mensagem e certifique-se de que diz Conexões OK para garantir que a matriz esteja bem posicionada no berço e que os eletrodos estejam bem alinhados com os sensores.
- Clique na guia Notas do experimento e preencha o máximo de informações possível sobre o experimento.
- Clique na guia Layout e preencha a descrição do layout da matriz.
- Clique na guia Agendar e adicione duas etapas no menu Etapas; uma etapa em segundo plano (uma varredura) e uma etapa de teste com 100 varreduras - uma varredura a cada 15 minutos, totalizando 25 h.
- Depois que a matriz estiver na incubadora do analisador de células de dupla finalidade por 30 minutos, clique no botão Reproduzir para iniciar a medição em segundo plano. Uma janela pedindo para escolher a pasta para salvar os dados aparecerá.
- Após a medição de fundo, remova a matriz do berço e coloque-a de volta na capa de cultura de células.
- Adicione as células à câmara superior conforme descrito na etapa 5.13 e mantenha o conjunto na capa de cultura de tecidos por 30 minutos para que as células se assentem.
- Coloque a matriz de volta no analisador de células de dupla finalidade e verifique a guia Mensagem para a mensagem Connections OK.
- Clique no botão Play para iniciar a medição da impedância.
- Clique na guia Plotar para monitorar o progresso do sinal.
- Se o ponto de extremidade for atingido antes de 25 h, clique na etapa Abortar no menu suspenso Executar.
- Para exportar dados, clique com o botão direito do mouse no gráfico, escolha Copiar no formato de lista e cole os dados em uma planilha.
nota: Os dados podem ser exportados como índice de célula ou índice de célula delta. As informações de gráfico e/ou layout também podem ser escolhidas para exportação.
Tabela 1: Composição dos meios de cultura celular. A tabela lista as composições de meios MDA-MD-231, meios de fibroblastos J2, meios DCIS e meios PDX.
| mídia | Constituintes | Concentração/proporção |
| Mídia MDA-MD-231 | DMEM | |
| Soro fetal bovino (FBS) | 10% de sucesso |
| J2 Fibroblastos meios | DMEM | |
| Soro fetal bovino (FBS) | 10% de sucesso |
| Mídia do CDIS | DMEM F12 | |
| Soro de cavalo (HS) | 5% de sucesso |
| Fator de crescimento epidérmico (EGF) | 20 ng/mL |
| insulina | 10 μg/mL |
| Hidrocortisona | 0,5 μg/mL |
| Toxina da cólera | 100 ng/mL |
| Mídia PDX | DMEM F12 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | 2% de sucesso |
| HEPES | 1 milhão |
| Insulina Transferrina Selênio Etanolamina (ITS) | 10 μg/mL |
| Hidrocortisona | 0,5 μg/mL |
| Albumina de soro bovino (BSA) | 1 mg/ml |
