Ensaio de Atividade de Citrato Sintase: Um Ensaio Colorimétrico para Medir a Atividade da Citrato Sintase Mitocondrial em Homogenato de Tecido de Drosophila

Resumo

Fonte: Wei, P., et al., Um ensaio colorimétrico da atividade da citrato sintase em Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medir o ensaio de atividade da citrato sintase mitocondrial presente no homogeneizado tecidual de Drosophila.

Protocolo

1. Ensaio de atividade colorimétrica da citrato sintase para D. melanogaster

1. Coletar dez moscas adultas para cada amostra. Coletar pelo menos amostras triplicadas para cada genótipo.
2. Prepare 500 μL de tampão de extração gelado contendo 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% de triton X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mL para cada amostra.
3. Anestesie moscas adultas com CO₂ em uma almofada de anestesia e isole os tecidos desejados. Para isolar os tórax da mosca adulta, por exemplo, fixe os tórax da mosca com um par de pinças e, em seguida, isole o abdômen da mosca cortando ao longo da borda do tórax e do abdômen usando uma tesoura. Colete os tórax das moscas para o ensaio de atividade da citrato sintase muscular.
   nota: Determine o peso fresco do tecido nesta etapa se estiver usando-o para normalizar a atividade da citrato sintase.
4. Transferir imediatamente 10 tórax de moscas adultas para 100 μL de tampão de extracção gelado e homogeneizar com um pilão sobre gelo. Para manter as amostras geladas, homogeneizar as amostras por 5-10 s no gelo, depois colocar as amostras no gelo por 5 s e repetir até que todos os tecidos do tubo estejam completamente homogeneizados.
   nota: Prenda o tubo, verifique os homogeneizados para se certificar de que não há coágulos nos homogeneizados e que os tecidos do tubo estão completamente homogeneizados. Todos os tratamentos de amostra devem ser realizados no gelo.
5. Retirar 10 μL de cada amostra homogeneizada num novo tubo para medição do teor de proteína. Manter as amostras para dosagem de proteína no gelo.
   nota: As amostras de proteínas podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para análise posterior. As concentrações de proteínas servem como parâmetro interno para normalização das atividades da citrato sintase.
6. Adicione 400 μL de tampão de extração gelado a cada amostra restante para perfazer um volume total de 500 μL. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos 5x, evitando a formação de bolhas. Para cada reacção, adicionar 1 μl de lisado celular diluído a 150 μl da solução de reacção recentemente preparada (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), DTNB 0,1 mM, acetil CoA 0,3 mM, ácido oxaloacético 1 mM). Misture bem e imediatamente pipetando suavemente, evitando a formação de bolhas. Medir a absorvância a 412 nm de 10 em 10 a 30 s durante 4 min a 25 °C, utilizando um leitor de placas capaz de medir a absorbância a 412 nm, a intervalos mínimos de 10 s.
   nota: Troque a ponta antes de pipetar um reagente diferente e evite formar bolhas nos poços. A mistura incompleta dos reagentes pode causar variações nas medições. O ensaio de atividade da citrato sintase deve ser feito à temperatura ambiente imediatamente após a coleta das amostras, pois este ensaio é usado para quantificar a massa mitocondrial intacta. O tampão de reação deve ser preparado imediatamente antes do uso e não deve ser armazenado.
7. Plote os dados como densidade óptica (OD) absorbância (abs) (eixo Y) versus tempo (em minutos) (eixo X). Em seguida, calcule a inclinação para a parte linear da curva, onde a taxa de reação é
   
   Divida o valor pela concentração de proteína da amostra para normalizar a atividade da citrato sintase. A atividade da citrato sintase é calculada como
   
   nota: A concentração de proteína da amostra pode ser medida por um kit de ensaio de concentração de proteína.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanossulfônico (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Base TRIZMA)	Sigma-Aldrich	V900483
Acetil-CoA	Sigma-Aldrich	Rolamento A2181
Ácido ditio-bis-nitrobenzóico (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
Oxaloacetato	Sigma-Aldrich	O4126
Pilão de pellets	Sangon	F619072
Motor de pilão de pellets	Tiangen	OSE-Y10
Leitor de placas	BioTek	éon
Kit de ensaio de BCA de proteína	Beyotime	Pág. 0010S
tesoura	WPI	Rolamento 14124
Tritão X-100	Sangon	A110694-0100