Ensaio de proteção enzimática baseado em lisostafina: um método in vitro para quantificar a carga intracelular de Staphylococcus aureus por morte seletiva mediada por enzima de bactérias extracelulares

Resumo

Fonte: Rigaill, J. et al. Ensaio de proteção enzimática aprimorada para estudar a internalização de Staphylococcus aureus e a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de proteção enzimática in vitro baseado em lisostafa para quantificar a internalização de Staphylococcus aureus em células A549. O ensaio auxilia em estudos qualitativos, quantitativos e de caracterização da carga bacteriana intracelular nas células hospedeiras.

Protocolo

1. Inoculação celular

1. Comece com uma cultura de células epiteliais humanas A549 no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alta glicose com vermelho de fenol, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) sem antibióticos.
2. Observe cada poço da placa de 24 poços por microscopia de baixa ampliação para garantir que as células epiteliais humanas estejam saudáveis e crescendo conforme o esperado.
3. Remova e descarte o meio de cultura de células gasto da placa de 24 poços.
4. Adicionar 500 μL da suspensão bacteriana de Staphylococcus aureus preparada em DMEM sem vermelho de fenol, para inoculação em cada poço com células 100% confluentes.
5. Incubar as células por 2 h a 36 ± 1 °C e 5% de CO₂,
   NOTA: recomenda-se usar três poços da placa para cada condição a ser testada (triplicata) e realizar pelo menos três experimentos independentes. O atraso de incubação pode ser adaptado de acordo com o objetivo experimental.

2. Quantificação de bactérias intracelulares com ensaio de proteção enzimática aprimorada (iEPA)

1. Prepare 7 mL de tampão de lise 4x com 3,5 mL de Triton X-100 a 2% em água estéril e 3,5 mL de tripsina-EDTA.
2. Preparar uma solução-mãe de lisostasfina a 10 mg/ml em tampão acetato e alíquota de 25 μL em crioviais. Conservar a -80 °C até 6 meses.
3. Prepare 250 μL de uma solução de trabalho de lisosafina fresca a 1 mg / mL misturando 25 μL da solução estoque de lisosafina (10 mg / mL) e 225 μL de Tris-HCl 0,1 M. Conservar a 4 °C até 48 h.
4. Prepare 6,25 mL de meio de infecção completo suplementado com lisosafina, adicionando 6 mL de meio de infecção completa a 250 μL da solução de trabalho de lisosafina.
5. Adicione 250 μL de meio de infecção completo suplementado com lisosafina em cada poço e agite suavemente a placa girando a placa com a mão.
6. Incubar as células por 1 h a 36 ± 1 °C em 5% de CO₂ para permitir que a lisosafina mate as bactérias extracelulares.
7. No final do tempo de incubação, adicione 10 μL de proteinase K a 20 mg / mL em cada poço para inativar a lisostafina.
8. Incube as células por 2 min em temperatura ambiente.
9. Adicione 250 μL de tampão de lise 4x para lisar as células por choque osmótico.
10. Incubar as células durante 10 min a 36 ± 1 °C.
11. Misture bem pipetando para cima e para baixo dez vezes em todo o fundo do poço para garantir que as células sejam totalmente lisadas e homogeneizadas.
12. Use um prato espiral automático para determinar a carga de S. aureus de cada poço.
13. Incubar as placas de ágar durante 18-24 h a 36 ± 1 °C.
14. No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular a carga intracelular de S. aureus de cada poço.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 24 poços	CORNING-FALCÃO	353047
Linha celular A549	ATCC	CCL-185
Solução tampão de acetato pH 4,6	Fluka	31048	Usado para preparar solução estoque de lisostpafina a 10 mg / mL em acetato de sódio 20 mM.
AMBICIN (lisostapina recombinante)	AMBI	LSPN-50	Lisostafina recominante liofilizada. Congele a -80 °C para armazenamento de longo prazo.
COS - Ágar Colômbia + 5% de sangue de ovelha	Biomerieux	Rolamento 43049	Qualquer placa de ágar adequada para o cultivo de estafilococos pode ser usada em seu lugar.
Meio de Eagle modificado de Dulbecco, glicose alta com vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	D6429
Meio de Eagle modificado de Dulbecco, glicose alta sem vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	D1145
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com MgCl2 e CaCl2, filtrada estéril	Sigma-Aldrich	D8662
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, filtrada estéril	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral diluído	Interscience	Nº 414000	Diluidor automático e chapa espiral
Soro fetal bovino	Gibco	10270-106
Proteinase K, recombinante 20 mg/ml	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, lote 901727
Digitalizar 4000	Interscience	Nº 438000	Contador automático de colônias
Água estéril	Otec	Nº 600500
TC20 Contador de células automatizado	Biorad	1450102	Contador automático de células
Tris 1 M pH 8,0	Invitrogen	AM9855G	Usado para preparar a solução de trabalho de lisostapina a 1 mg / mL em Tris-HCl 0,1 M.
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tripsina - solução de EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	0,05% de tripsina suína e 0,02% de EDTA em solução salina balanceada Hanks com vermelho de fenol
Microscópio de fluorescência de campo amplo	Nikon	Ti2