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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Preparação da solução
NOTA: Manuseie e prepare todos os reagentes e soluções com vidraria sem ferro ou plástico descartável. Não permita que materiais metálicos de laboratório (por exemplo, espátulas de aço inoxidável) entrem em contato com qualquer reagente ou solução, devido ao risco de contaminação por ferro. Certifique-se de que qualquer copa reutilizável não tenha ferro. Lave os materiais com detergente de laboratório apropriado por 30-60 min, enxágue com água deionizada, mergulhe durante a noite em uma solução de ácido nítrico a 37% diluída 1:3 com água deionizada, enxágue novamente com água deionizada e deixe secar.
- Mistura ácida: Adicione 10 g de ácido tricloroacético a 82,2 mL de ácido clorídrico a 37% em um frasco de vidro, dissolva bem e ajuste o volume final para 100 mL com água deionizada. Agite antes de usar. Como alternativa, use apenas ácido clorídrico a 37% para a digestão dos tecidos.
nota: A solução é estável por pelo menos 2 meses quando armazenada em frascos de reagentes de vidro marrom escuro.
cuidado: O ácido clorídrico e o ácido tricloroacético são corrosivos e as formas concentradas liberam vapores ácidos tóxicos. Use roupas de proteção, luvas resistentes a produtos químicos e óculos de proteção contra respingos de produtos químicos o tempo todo ao manusear ácidos. Evite respirá-los e sempre manuseie os ácidos enquanto estiver sob um exaustor.
- Acetato de sódio saturado: Adicione 228 g de acetato de sódio anidro a 400 mL de água deionizada em uma garrafa de vidro e agite durante a noite em temperatura ambiente. Deixe a solução descansar e precipitar por um dia. Se não ocorrer precipitação, continue adicionando pequenas quantidades de acetato de sódio. Conservar a solução num frasco de vidro.
- Reagente de cromogênio: Para preparar 1 mL de reagente de cromogênio, adicione 1 mg de sal dissódico de ácido dissulfônico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL de água deionizada e 10 μL de ácido tioglicólico concentrado (100%) e dissolva completamente. Completar o volume final para 1 mL com água deionizada.
nota: Prepare a quantidade de reagente cromógeno necessária. A solução é estável por 1 mês quando protegida da luz.
- Reagente de Cromogênio de Trabalho (WCR): Adicione 1 volume de Reagente de Cromogênio a 5 volumes de acetato de sódio saturado e 5 volumes de água deionizada.
nota: Esta solução deve ser preparada na hora no dia da utilização.
- Solução padrão de ferro de estoque: Para preparar uma solução de ferro de estoque de 20 mM, coloque 111,5 mg de pó de ferro carbonílico em um balão volumétrico de 250 mL contendo 5.480 μL de ácido clorídrico a 37%. Deixe dissolver durante a noite em temperatura ambiente (ou incube em banho-maria fervente). Em seguida, completar a solução até um volume final de 100 mL com água deionizada.
nota: A solução-padrão pode ser mantida indefinidamente quando armazenada em um recipiente hermeticamente fechado.
- Solução padrão de ferro de trabalho (WISS): Adicione 13,5 μL de ácido clorídrico a 37% a 500 μL de água deionizada. Adicionar 10 μL da solução-padrão de ferro de estoque e completar o volume final para 1 mL com água deionizada (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; medido por AAS).
nota: A solução de trabalho deve ser preparada na hora no dia da utilização.
2. Secagem da amostra
- Corte uma amostra de tecido pesando 10-100 mg com uma lâmina de bisturi. Pese-o com precisão em uma balança analítica / de precisão sobre um pequeno pedaço de parafilme (Fresh Weight).
- Usando uma pinça de plástico, coloque o pedaço de tecido em uma placa de 24 poços (sem tampa para permitir a evaporação da água) e deixe secar em uma incubadora padrão a 65 ° C por 48 h.
- Como alternativa, use um forno de digestão por microondas de laboratório para secar amostras de tecido. Usando uma pinça de plástico, coloque o pedaço de tecido pesado em um copo de Teflon sem ferro e seque-o no micro-ondas. Defina os parâmetros de operação de acordo com o manual de instruções do instrumento.
nota: Como referência, os parâmetros operacionais para secagem de amostras de fígado usando o forno de digestão específico (ver Tabela de Materiais) são mostrados na Tabela 1.
- Usando uma pinça de plástico, coloque cada pedaço de tecido seco sobre um pequeno pedaço de parafilme dentro de uma balança analítica / de precisão e pese-o com precisão (peso seco).
3. Amostra de digestão ácida
- Usando uma pinça de plástico, transfira cada pedaço de tecido seco para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 1 mL da mistura ácida e feche o tubo da microcentrífuga. Prepare um branco ácido da mesma maneira, exceto que o tecido é omitido.
cuidado: A mistura ácida é corrosiva e libera vapores tóxicos. Use roupas de proteção, luvas resistentes a produtos químicos e óculos de proteção contra respingos de produtos químicos ao manusear a mistura ácida. Evite respirá-lo e sempre manuseie-o sob um exaustor.
- Digerir os tecidos incubando os tubos de microcentrífuga numa incubadora a 65 °C durante 20 h.
- Após o resfriamento à temperatura ambiente, transfira 500 μL do extrato ácido claro (amarelo) (sobrenadante) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma micropipeta equipada com pontas de plástico. Se não for possível obter um sobrenadante claro, execute um centrifugador curto.
cuidado: O sobrenadante é altamente ácido. Use roupas de proteção, luvas resistentes a produtos químicos e óculos de proteção contra respingos de produtos químicos ao manusear os sobrenadantes. Sempre manuseie-os sob uma hotte.
nota: Neste ponto, os extratos ácidos podem ser usados imediatamente para o ensaio colorimétrico ou congelados a -20 °C para uso posterior. Descongele completamente as amostras congeladas à temperatura ambiente e vórtice-as antes de usar.
4. Desenvolvimento de cores
- Prepare as reações de cromogênio conforme indicado na Tabela 2 em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL ou, para maior rendimento, diretamente nas microplacas de poliestireno transparente, não tratadas, de fundo plano, de 96 poços. Preparar todas as reacções (ácido em branco, padrão e amostra) pelo menos em duplicado.
- Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
5. Leitura da absorvância
- Meça a absorbância da amostra em um espectrofotômetro ou leitor de placas em um comprimento de onda de 535 nm em relação a uma referência de água deionizada. As placas podem ser lidas sem tampa ou com tampa. No estojo com tampa, remova qualquer condensação formada devido à liberação de vapores ácidos da tampa imediatamente antes da medição para evitar possíveis interferências na leitura da absorbância.
nota: A absorbância óptica do branco ácido lido contra água deionizada (referência) deve ser inferior a 0,015; A absorbância óptica do padrão e das amostras deve estar entre 0,100 e 1,000. Para amostras com teor de ferro muito alto ou muito baixo, os volumes de extrato ácido (sobrenadante) e diH2O podem precisar ser ajustados (Tabela 2): se a absorbância for superior a 1,0, use um volume de amostra menor (sobrenadante); Quando a absorbância for inferior a 0,1, use um volume maior do sobrenadante. O volume da amostra (Vsmp) é levado em consideração ao calcular o teor de ferro tecidual de cada amostra (consulte a etapa 6).
6. Cálculo do teor de ferro nos tecidos
- Calcule o teor de ferro no tecido não heme com a seguinte equação:
Ferro tecidual (μg/g de tecido seco) = Equação 1
AT = absorvância da amostra de ensaio
AB = absorbância do ácido em branco
AS = absorbância do padrão
Fes = concentração de ferro no WISS (μg Fe/mL)
W = peso do tecido seco (g)
Vsmp = volume da amostra (volume variável do sobrenadante na Tabela 2 convertido em mL)
Vf = volume final da mistura ácida após incubação durante a noite a 65 °C (correspondente ao volume de ácido mais o volume de tecido seco em ml; se os pesos das amostras não diferirem significativamente, assumir um volume constante ≈ 1 ml)
Vstd = volume padrão de ferro (volume de WISS na Tabela 2 convertido em mL)
Vrv = volume final da reação (volume total na Tabela 2 convertido em mL)
Tabela 1: Parâmetros operacionais para secagem do fígado em um forno de digestão por microondas usado aqui
| Potência 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Pressão (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tempo (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tempo de pressão (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ventilador: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabela 2: Preparação de reações cromógenas em tubos de 1,5 mL ou placas de 96 poços.
| | WCR (μL) | Mistura ácida (μL) | Sobrenadante (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volume total (μL) |
| Tubos de 1,5 mL | Ácido em branco | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| padrão | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| amostra | 1000 | | variável | | variável | 1300 |
| 96 poços | Ácido em branco | 150 | 22,5 | | | 22,5 | 195 |
| padrão | 150 | 22,5 | | 22,5 | | 195 |
| amostra | 150 | | variável | | variável | 195 |