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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Expansão dos progenitores OC
- Ressuspenda PBMCs em α-MEM completo (10% FBS, 1% Caneta / Strep, 1% anfotericina B) contendo 20 ng / mL M-CSF. Semeie PBMCs em uma densidade de 2,5 x 105 células/cm2. Normalmente, as células isoladas de 15-20 mL de sangue fresco podem ser semeadas em um frasco de 75 cm2 (1,5-2 x 107 células).
- Alimente as células com α-MEM completo fresco contendo 20 ng/mL M-CSF a cada três dias até que as células anexadas atinjam a confluência desejada. Os rendimentos típicos são 1,5-2 x106 células/frasco quando as células são 95% confluentes. Normalmente, o período de expansão dura 6 dias.
nota: O potencial osteoclastogênico dos precursores pode diminuir com o tempo prolongado de cultivo.
2. Indução da osteoclastogênese em placas revestidas com fosfato de cálcio
- Para facilitar a adesão celular, incube as placas revestidas de fosfato de cálcio (CaP) com 50 μL de FBS por 1 h em uma incubadora a 37 ° C.
- Para separar os precursores de CO, lave o frasco com PBS duas vezes para remover as células mortas ou não aderentes. Adicionar 4 ml de tripsina (Tabela de Materiais) por balão de 75 cm2, durante 30 min.
- Adicione 4 mL de α-MEM completo para interromper a digestão, retire cuidadosamente as células usando um raspador de células e transfira as células para um tubo de 50 mL.
- Determine o número total de células usando uma câmara de Neubauer ou similar.
- Pulverize as células por centrifugação por 7 min a 350 x g. Ressuspenda o pellet em α-MEM completo suficiente contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL para obter uma concentração de 1 x 106 células/mL.
- Aspire a solução de FBS da placa de 96 poços revestida com CaP e pipete 200 μL de suspensão de células por poço (2 x 10,5 células/poço).
- Incubar os precursores de CO durante o período de tempo desejado ou com os reagentes desejados relevantes para o desenho experimental. Normalmente, um grande número de COs grandes e multinucleados pode ser observado após 6 dias e quando os poços de reabsorção estão se formando. Alimentar as células com meio α-MEM completo fresco contendo 20 ng/ml de M-CSF e 20 ng/ml de RANKL de três em três dias.
- No final da incubação, lave as células com PBS duas vezes, fixe com paraformaldeído a 4% por 10 min e lave com PBS novamente.
- Utilizar os OC fixos directamente para a coloração de fluorescência ou conservá-los a 4 °C.
3. Coloração de fluorescência de OCs e revestimento de fosfato de cálcio
- Incube as células fixas com tampão de permeabilização (0,1% Triton em PBS) por 5 min.
- Manchar os filamentos de actina com 100 μL de solução de faloidina marcada com AlexaFluor 546 em PBS por 30 min e aspirar a solução de coloração. Adicione 100 μL de solução de coloração Hoechst 33342 (10 μg/mL em PBS) por 10 min para corar os núcleos. O DAPI também pode ser usado.
- Manchar o revestimento de CaP com 100 μL de calceína 10 μM em PBS por 10 min. Lave três vezes com PBS e tire imagens.