Ensaio de oxidação de substrato em células cultivadas: um ensaio in vitro para quantificar a oxidação de substrato em células medindo sinais radioativos de CO2 aprisionado

Resumo

Fonte: Song, C. et al., Avaliando a oxidação do substrato energético in vitro com aprisionamento de ¹⁴CO₂. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra uma técnica de quantificação para CO₂ liberado durante a oxidação do substrato usando ¹⁴substratos radiomarcados com C. O ¹⁴CO₂ liberado é preso em uma solução alcalina e quantificado por um contador de cintilação. A oxidação de diferentes substratos varia entre os tecidos e reflete a condição fisiopatológica do tecido.

Protocolo

O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia de um comitê de segurança designado em cada instituição.

1. Preparação de soluções-mãe para ¹⁴substratos marcados com C

1. Faça 4 mM de solução estoque de albumina de soro bovino (BSA) misturando 11 g de BSA e 33,1 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e agitando-a suavemente à temperatura ambiente por ~ 3 h até que o BSA esteja totalmente dissolvido. Aqueça a solução estoque de BSA em banho-maria a 70 °C antes de usar.
2. Seque ao ar 50 μCi ¹⁴C-oleato (50 μCi/μmol em etanol) no frasco para injetáveis com a tampa fechada durante 8 h numa coifa de trabalho RAM designada. Adicione 312,5 μL de H₂O e, em seguida, 3,5 mg (11,5 μmol) de oleato de sódio. Homogeneizar.
3. Aquecer a solução resultante a 70 °C em banho-maria. Adicione 0,9375 mL da solução-mãe BSA pré-aquecida para obter 10 mM de solução estoque de oleato quente (contendo uma proporção de 1:11,5 de ¹⁴C-oleato para oleato não marcado). Aliquotar a solução-mãe e armazená-la a -20 °C para uso a longo prazo.
4. Use ¹⁴C-glicose e ¹⁴C-glutamina diretamente após o descongelamento.

2. Preparação de meio contendo ¹⁴substratos marcados com C

NOTA: Para garantir concentrações confiáveis de substratos energéticos no meio, o meio feito sob medida deve ser usado com substratos novos adicionados pouco antes do uso. Aqui, é usado um meio essencial mínimo (MEMα) feito sob medida sem glicose, piruvato, glutamina, vermelho de fenol ou bicarbonato de sódio. No entanto, um meio ideal deve ser determinado para cada tipo de célula.

1. Reconstitua 8,67 g do pó médio em 1 L de água purificada. Adicione 2,2 g de bicarbonato de sódio para atingir um pH de 7,4 e filtre a solução usando filtração a vácuo de 0,22 μm.
2. Adicione ingredientes frescos para obter o meio completo (cMEMα) com concentrações finais de 5,5 mM de glicose, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato e 10% de soro fetal bovino (FBS). Suplementar ainda cMEMα com 100 mM de L-carnitina e 10 μM de HEPES para facilitar a oxidação dos ácidos gordos.
3. Imediatamente antes de usar, adicione ¹⁴substratos marcados com C ao cMEMα recém-preparado para fazer mídia quente. Para tornar o oleato quente médio, adicione a solução estoque de oleato quente 10 mM ao cMEMα para uma concentração final de 100 μM de oleato (diluição 1:100, radioatividade final 0,4 μCi / mL).
   nota: O estoque de oleato quente de 10 mM contendo uma proporção de 1:11,5 de oleato quente: frio (consulte a etapa 1.3) é usado para atingir um nível fisiológico de 100 μM de oleato total no meio, minimizando a quantidade de material radioativo.
4. Faça 10 mM de estoque de oleato não rotulado adicionando 24,36 mg de oleato de sódio a 2 mL de H₂O em banho-maria a 70 ° C por ~ 20 min até dissolver completamente antes de misturar rapidamente com 6 mL da solução estoque BSA 4 mM pré-aquecida a 70 ° C. Transfira para um banho-maria a 37 ° C por 1 h e filtre através de um filtro de 0,22 μm. Alíquota e conservar a -20 °C para utilização a longo prazo.
5. Para tornar a glicose meio quente, adicione ¹⁴C-glicose a uma concentração final de 1,333 μM (diluição 1:4.125, radioatividade final 0,4 μCi/mL). Para tornar a glutamina meio quente, adicione ¹⁴C-glutamina à concentração final de 2 μM (diluição 1:1.000, radioatividade final de 0,4 μCi/mL).
6. Suplementar o meio quente de glicose e glutamina com uma solução-mãe de 10 mM de oleato não marcado da etapa 2.4 para atingir a concentração final de 100 μM de oleato, a mesma que no meio quente de oleato.

3. Preparação das células

NOTA: Pré-osteoblastos da calvária e macrófagos da medula óssea são usados como exemplos aqui. Os usuários devem preparar o tipo de célula de sua escolha de acordo com os protocolos apropriados. Otimize a concentração de colagenase II a ser usada para digestão em experimentos piloto, pois a atividade enzimática pode variar entre os diferentes lotes.

1. Isolamento e cultura de pré-osteoblastos da calvária
   1. Sacrifique os filhotes pós-natais do dia 3-5 (P3-5) por decapitação e transfira-os para DPBS gelados contendo penicilina-estreptomicina (P / S).
   2. Exponha a calvária removendo a pele e os tecidos moles. Colete a região do meio cortando os tecidos circundantes de trás para frente na DPBS ( Figura 1A ). Raspe as superfícies interna e externa da calvária suavemente usando uma pinça para ajudar a liberar as células na digestão subsequente.
   3. Prepare uma solução de 2 mg / mL e 4 mg / mL de colagenase tipo II em DPBS e filtre cada solução com um filtro novo de 0,22 μm. Digerir primeiro a calvária limpa com a solução de colagenase a 2 mg/ml durante 15 min e eliminar a solução de digestão. Digerir as amostras limpas em solução de colagenase 4 mg/ml 3 vezes durante 15 minutos de cada vez, acumulando e guardando a solução de digestão.
   4. Filtrar a solução de digestão através de filtros de células de 70 μm e centrifugar o filtrado a 300 × g durante 5 min. Ressuspender o sedimento celular em cMEMα (ver passo 2.2) contendo 10% de FBS e P/S.
   5. Conte e semeie as células a 4 ×^{10 4} células/cm² em placas de 10 cm. Cultivar as células numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante 3 dias.
   6. Dissocie as células a 37 °C com 0,25% de tripsina-EDTA. Conte e semeie as células em placas de cultura de células de 24 poços com cMEMα contendo 10% de FBS e P / S a 7,5 × 10⁵ / cm². Semear pelo menos 4 alvéolos por tipo de célula por substrato e pelo menos três alvéolos adicionais para cada tipo de célula para contagem de células antes do ensaio.
   7. Cultivar as células a 37 °C durante a noite antes dos ensaios de oxidação do substrato.
2. Isolamento e cultura de BMMs
   NOTA: A cultura de BMMs requer fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), que pode ser adquirido comercialmente como uma proteína recombinante. O meio condicionado da linha celular CMG14-12 projetado para expressar M-CSF é uma alternativa econômica usada aqui.
   1. Colete fêmures e tíbias de camundongos de 8 semanas de idade após a remoção do músculo e dos tecidos conjuntivos. Corte e descarte as duas pontas dos ossos com uma tesoura afiada.
   2. Lave a medula óssea de um fêmur e uma tíbia em uma placa de Petri de 10 cm com uma seringa equipada com uma agulha de 23 G contendo 15 mL de cMEMα com 10% de FBS, P/S e 10% de meio condicionado CMG14-12 (meio BMM). Cultivar as células na placa de Petri numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   3. Após 3 dias, descarte o meio de cultura e enxágue com DPBS. Dissocie as células ligadas a 37 ° C com 0,25% de tripsina-EDTA por 5 min. Centrifugue e ressuspenda o pellet celular no meio BMM.
   4. Contar e semear as células em placas de cultura de células de 24 poços a 7,5 × 10⁵/^cm2 do mesmo modo descrito no ponto 3.1.6. Cultura a 37 °C durante a noite no meio BMM antes de iniciar os ensaios.

4. Ensaio de oxidação do substrato com armadilha de CO₂

NOTA: Uma densidade de semeadura apropriada deve ser determinada para cada tipo de célula para atingir 80-90% de confluência antes do início do ensaio. Observe que a densidade celular pode afetar o estado metabólico das células.

1. Lave as células nos poços extras duas vezes com DPBS. Dissocie as células com 0,25% de tripsina-EDTA e células mistas de 20 μL ressuspensas em DPBS com 20 μL de solução de corante comercial de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) pronta para uso. Determine o número de células ativas com um contador de células automatizado e registre o número para cálculos finais.
2. Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com DPBS. Adicione 500 μL de meio quente a cada poço de ensaio na capa de cultura de tecidos designada por RAM. Selar as placas com parafilme e incubar as células numa incubadora designada para RAM a 37 °C durante 4 h.
3. Durante a incubação, corte o papel de filtro em pedaços circulares ligeiramente maiores do que a área dentro da tampa dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e insira o papel confortavelmente na tampa (Figura 1B). Adicione 200 μL de ácido perclórico 1 M a cada tubo e 20 μL de hidróxido de sódio ao papel de filtro colocado dentro da tampa.
4. Após a incubação das células, transferir 400 μL de meio de cultura de cada alvéolo para os tubos preparados e fechar imediatamente as tampas. Deixe os tubos em um suporte para tubos em temperatura ambiente por 1 h.
5. Durante a incubação, coloque um frasco de cintilação para cada tubo e encha-o com 4 mL de fluido de cintilação. Transfira cada pedaço de papel de filtro para um frasco de cintilação e incube em temperatura ambiente por 30 min.
6. Realize testes de limpeza na capa de cultura de tecidos, no banho-maria (usado para preparação de ¹⁴C-oleato), geladeira, incubadora, pia, solo e qualquer outra área de trabalho para possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.
7. Meça ¹⁴C de radioatividade nos frascos de cintilação com um contador de cintilação. Registre os resultados da leitura. Descontamine o ambiente de trabalho de acordo com as diretrizes de segurança contra radiação, se necessário.

Resultados

Figura 1: Diagramas para ensaio de captura de CO₂ e dissecção da calvária. (A) A região central da calvária, indicada pelo triângulo tracejado laranja, é colhida para isolamento celular. (B) Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL são usados para captura de CO₂ (etapa 1). Os papéis de filtro (papel azul para fins ilustrativos) são cortados para caber...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtros de 0,22 μm	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Usado para filtrar a solução BSA
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco	25200056	Dissociar células da cultura de células Placas
Tubos Eppendorf de 1,5 mL	PR1MA	PR MCT17 RB	Usado para incubação de reação
Placas de 10 cm	TPP	Rolamento 93100	Usado para cultura de células
Seringa de 10 mL	Bd	302995	Usado para lavar a medula de long osso
10% FBS	Biológicos de Atlanta	S11550	Para preparação de meio de cultura celular
14C -Glicose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Usado para fazer mídia quente
14 C-glutamina	PerkinElmer	NEC451050UC	Usado para fazer mídia quente
14 C-oleato	PerkinElmer	NEC317050UC	Usado para fazer mídia quente
Agulha de 23 G	Bd	Rolamento 305120	Usado para lavar a medula de long osso
Placas de 24 poços	TPP	Rolamento 92024	Usado para cultura de células
Filtros de células de 70 μm	MEIO	70 CÉLULAS	Usado para filtrar o sobrenadante durante digestão cavarial
Laranja de Acridina/Iodeto de Propídio (AO/PI) corante	Nexcelom Biociências	CS2-0106	Cora células vivas para determinar a semente densidade
Soro Bovino Ablumin	Produtos Biológicos Proliant	Nº 68700	Usado para conjugação de ácidos graxos
Celómetro Auto 2000	Nexcelom Biociências		Determine o número de células viáveis
centrifuga	Thermo Fisher	Lenda Micro 21R	Usado para pellet células
Colagenase tipo II	Worthington	LS004176	Dissociar células do tecido
Alfa do MEM personalizado	GIBCO	REF: ME 18459P1	Usado para criar mídia quente personalizada
Tamponamento fosfato de Dulbecco Salino	Gibco	10010023	Usado para dissolver e diluir reagentes, e lavar pratos de cultura
Papel de filtro	Millipore-Sigma	WHA1001090	Armadilhas de CO 2 com hidróxido de sódio
glicose	Sigma-Aldrich	G7528	Usado para fazer mídia personalizada
HEPES	Gibco	15630080	Captura CO 2 durante a cultura de células
L-carnitina	Sigma-Aldrich	C0283	Suplementado para oxidação de ácidos graxos
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	Usado para fazer mídia personalizada
MEM alfa	Thermo	A10490	Meio de cultura celular
Parafilme	Embalagens Plásticas Pecheney	PM998	Usado para selar placas de cultura de células
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher	15140122	Previne a contaminação em cultura de células
Ácido Perclórico	Sigma-Aldrich	244252	Libera CO 2 durante o metabolismo Análise
Piruvato	Sigma-Aldrich	pág. 5280	Usado para fazer mídia personalizada
Contador de Cintilação	Beckman Coulter	LS6500	Determina a radioatividade do papel de filtro
Fluido de cintilação	MP Biomédicos	882453	Absorva a energia emitida pelas RAMs e reemite-o como flashes de luz
Frasco de cintilação	Fisher Científico	03-337-1	Recipientes de reação para cintilação fluido
Carbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761	Buffer de saldo para médio
hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	Rolamento 58045	Retém CO2 durante o ensaio de metaboilc
Oleato de sódio	Santa Cruz	SC-215879	Ácido graxo conjugado BSA preparação
Filtragem a vácuo 1000	TPP	Rolamento 99950	Filtro cMEMα