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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Preparação do LED para iluminação de luz azul
- Ligue um painel de LED usando o aplicativo associado instalado em um tablet/telefone. Coloque a sonda de um espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços e ajuste a luz LED para o comprimento de onda com pico de ~ 456 nm através da aplicação. Coloque o sensor óptico de um medidor de potência óptica no poço vazio e ajuste a potência da luz LED (~0.61 mW/cm2). A configuração da luz LED pode ser salva e pode ser recuperada no aplicativo.
- Introduza a configuração do painel de prato/LED na incubadora a 28 °C. Conclua esta etapa antes que a imagem dos peixes comece a 48 hpf.
2. Imagem de larvas de peixe-zebra expressando TDP-43 optogenético
- Selecione Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixes duplamente transgênicos pelo menos antes de 47 hpf, com base na fluorescência RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando o microscópio de epifluorescência equipado com uma lente objetiva Plan-Neofluar 5x/0,15.
- Decorionate o Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo.
- Pré-aqueça a 1% de agarose de baixa temperatura de fusão contendo 250 μg / mL de sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato a 42 ° C.
- Anestesie brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peixes duplamente transgênicos a 48 hpf em tampão E3 contendo a mesma concentração de tricano.
- Coloque uma gota da agarose pré-aquecida de baixa temperatura de fusão a 1% no prato de base de vidro à temperatura ambiente. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro é de 8 a 10 mm.
- Usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à agarose de baixa temperatura de fusão no prato de base de vidro e, em seguida, misture pipetando algumas vezes. Minimize a quantidade de tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe.
- Mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa durante a solidificação da agarose (normalmente ~ 1 min) para garantir que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Após a solidificação, coloque algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula.
- Adquira seções z confocais seriais da medula espinhal por varredura com um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão em água de 20x com a abertura numérica de 1,00, usando uma velocidade de varredura de 4,0 μs por pixel (12 bits por pixel), um tamanho de passo de 1,0 μm por fatia para a objetiva e uma combinação de comprimentos de onda de excitação/emissão: Canal 1) 473/510 nm para EGFP e Canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
nota: A cloaca no lado ventral do peixe está incluída nas regiões de interesse (ROI) como referência, o que ajuda a identificar e comparar os segmentos da coluna vertebral (níveis 16-17) ao longo dos pontos de tempo.
- Remova o peixe da agarose quebrando-a cuidadosamente com uma agulha de seringa assim que a imagem estiver concluída. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe fica embebido na agarose o mais curto possível, embora a incorporação de agarose por <30 min não afete a viabilidade do peixe.
3. Estimulação luminosa de peixes que expressam opTDP-43h por iluminação de campo de uma luz de diodo emissor de luz azul (LED)
- Adicione 7,5 mL de tampão E3 ao poço e coloque o peixe transgênico duplo Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] com imagem no poço. Coloque o prato de seis poços no painel de LED, mantendo o prato e o painel de LED separados por 5 mm com um espaçador (por ex.ample, com cinco copos de lâmina empilhados).
- Ligue a luz LED azul. Mantenha alguns dos peixes transgênicos duplos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] em um prato separado de seis poços coberto com papel alumínio quando peixes de controle não iluminados forem necessários (ou seja, em condições escuras).
- Após a iluminação (por exemplo, por 24 h a 72 hpf na Figura 1), crie uma imagem da medula espinhal do peixe iluminado repetindo as etapas 2.3 - 2.9.
