Ensaio de Separação de Fase de Proteína: Um Método Optogenético para Separação de Fase de Proteína de Ligação a RNA Mutante em Neurônios Motores Espinhais de Larvas de Peixe-Zebra

Neste artigo

Resumo

Fonte: Asakawa, K. et al. Transição de fase optogenética de TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2022)

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de separação de fases, em que proteínas intracelulares compreendendo regiões intrinsecamente desordenadas fundidas a um domínio de oligomerização fotossensível são induzidas por meio de exposição à luz azul para se autoassociarem em condensados semelhantes a líquidos sem membrana.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE

1. Preparação do LED para iluminação de luz azul

Ligue um painel de LED usando o aplicativo associado instalado em um tablet/telefone. Coloque a sonda de um espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços e ajuste a luz LED para o comprimento de onda com pico de ~ 456 nm através da aplicação. Coloque o sensor óptico de um medidor de potência óptica no poço vazio e ajuste a potência da luz LED (~0.61 mW/cm²). A configuração da luz LED pode ser salva e pode ser recuperada no aplicativo.
Introduza a configuração do painel de prato/LED na incubadora a 28 °C. Conclua esta etapa antes que a imagem dos peixes comece a 48 hpf.

2. Imagem de larvas de peixe-zebra expressando TDP-43 optogenético

Selecione Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixes duplamente transgênicos pelo menos antes de 47 hpf, com base na fluorescência RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando o microscópio de epifluorescência equipado com uma lente objetiva Plan-Neofluar 5x/0,15.
Decorionate o Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo.
Pré-aqueça a 1% de agarose de baixa temperatura de fusão contendo 250 μg / mL de sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato a 42 ° C.
Anestesie brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peixes duplamente transgênicos a 48 hpf em tampão E3 contendo a mesma concentração de tricano.
Coloque uma gota da agarose pré-aquecida de baixa temperatura de fusão a 1% no prato de base de vidro à temperatura ambiente. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro é de 8 a 10 mm.
Usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à agarose de baixa temperatura de fusão no prato de base de vidro e, em seguida, misture pipetando algumas vezes. Minimize a quantidade de tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe.
Mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa durante a solidificação da agarose (normalmente ~ 1 min) para garantir que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Após a solidificação, coloque algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula.
Adquira seções z confocais seriais da medula espinhal por varredura com um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão em água de 20x com a abertura numérica de 1,00, usando uma velocidade de varredura de 4,0 μs por pixel (12 bits por pixel), um tamanho de passo de 1,0 μm por fatia para a objetiva e uma combinação de comprimentos de onda de excitação/emissão: Canal 1) 473/510 nm para EGFP e Canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
nota: A cloaca no lado ventral do peixe está incluída nas regiões de interesse (ROI) como referência, o que ajuda a identificar e comparar os segmentos da coluna vertebral (níveis 16-17) ao longo dos pontos de tempo.
Remova o peixe da agarose quebrando-a cuidadosamente com uma agulha de seringa assim que a imagem estiver concluída. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe fica embebido na agarose o mais curto possível, embora a incorporação de agarose por <30 min não afete a viabilidade do peixe.

3. Estimulação luminosa de peixes que expressam opTDP-43h por iluminação de campo de uma luz de diodo emissor de luz azul (LED)

Adicione 7,5 mL de tampão E3 ao poço e coloque o peixe transgênico duplo Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] com imagem no poço. Coloque o prato de seis poços no painel de LED, mantendo o prato e o painel de LED separados por 5 mm com um espaçador (por ex.ample, com cinco copos de lâmina empilhados).
Ligue a luz LED azul. Mantenha alguns dos peixes transgênicos duplos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] em um prato separado de seis poços coberto com papel alumínio quando peixes de controle não iluminados forem necessários (ou seja, em condições escuras).
Após a iluminação (por exemplo, por 24 h a 72 hpf na Figura 1), crie uma imagem da medula espinhal do peixe iluminado repetindo as etapas 2.3 - 2.9.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

figure-results-1
Figura 1: Comparações raciométricas de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z antes e depois da estimulação luminosa. (A) As ROIs cobrindo os somas de quatro células únicas positivas para mnr2b a 48 e 72 hpf foram desenhadas com base no sinal EGFP-TDP-43z e são mostradas em magenta. As ROIs retangulares (bg) foram usadas para subtrair o sinal de fundo (ROI de fundo). As figuras são adaptadas de As...