Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Triagem in vitro de pequenas moléculas
- Prepare as placas de ensaio seguindo as etapas abaixo.
- Despeje água destilada autoclavada em uma calha estéril e, usando uma pipeta multicanal, dispense 40 μL de água destilada da calha em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços.
- Prepare a ferramenta de fixação e adicione os produtos químicos.
- Configure bandejas de pinner (consulte a Tabela de Materiais) perto de uma chama de bico de Bunsen em uma bancada de laboratório. Adicione o seguinte às bandejas de pinner sucessivas: 25 mL de solução de limpeza de pinos, 35 mL de DMSO a 50% (em água), 45 mL de água destilada, 55 mL de EtOH a 70% e 65 mL de EtOH a 95%. Coloque um pedaço de papel mata-borrão na frente de cada bandeja.
- Limpe a ferramenta de fixação emergindo os pinos na solução de limpeza e movendo os pinos para cima e para baixo três vezes (3x) na solução. Neste protocolo, '3x' e '10x' são definidos como mover o pinador para cima e para baixo em uma solução três ou dez vezes, respectivamente. Seque os alfinetes no mata-borrão. Repita este procedimento mais uma vez.
- Em seguida, enxágue os pinos 3x em água destilada, seguido de enxugar os pinos. Repita o procedimento mais uma vez.
- Por fim, enxágue os pinos 3x em EtOH a 95%, seguido de enxugar os pinos. Repita mais uma vez. Acenda o pinador e deixe o etanol evaporar.
- Adicione produtos químicos das placas de estoque de produtos químicos de 96 poços às placas de ensaio, fixando 3x na placa química e, em seguida, transferindo os pinos 10X para a placa de ensaio. Seque no papel na frente da solução de limpeza.
- Limpe a ferramenta de fixação entre as placas lavando na seguinte ordem, enxugando no meio em papel mata-borrão: 3x em 50% DMSO (uma vez), 3x em água destilada (uma vez), 3x em 75% EtOH (uma vez), 3x em 95% EtOH (duas vezes). Acenda o pinador e deixe o etanol evaporar.
- Repita a etapa 1.2.2 quando toda a fixação for concluída.
nota: A triagem foi realizada na concentração final de 60 μM.
- Adição de minhocas
- Conte o número de nematóides da coleção primeiro ressuspendendo e depois pipetando 5 μL usando pontas de baixa retenção em uma lâmina para observação. Contar o número de nemátodes em 5 μL utilizando um microscópio de dissecação.
- Ajustar a concentração para 2 vermes/μL utilizando água destilada estéril. Usando uma pipeta multicanal e uma calha, adicione 10 μL (~20 vermes) a cada poço das placas de 96 poços.
nota: Aproximadamente 15.000 nematóides D. dipsaci serão coletados por placa de cultura usando o método de cultura e coleta descrito. Vinte vermes são usados por poço porque o pequeno número facilita a visualização clara e a contabilidade dos móveis e imóveis.
- Sele as placas em filme de embalagem de laboratório e embrulhe com uma toalha de papel úmida. Coloque na caixa e fixe em uma almofada adesiva em incubadora agitada a 20°C ajustada a 200 rpm. Certifique-se de que os pratos estejam estabilizados na caixa adicionando um damp toalha de papel extra para garantir o mínimo de movimento dos pratos.
2. Coleta e análise dos dados
- Observe as placas no dia 5 sob um microscópio de dissecação. Conte o número de M. dipsaci móvel e o número total de D. dipsaci em controles de solvente DMSO e poços tratados com drogas.
- Se os vermes estiverem relativamente imóveis, adicione 2 μL de NaOH 1 M a uma concentração final de 40 mM no poço para estimular o movimento.
nota: Depois de adicionar NaOH, os vermes se moverão instantaneamente e precisam ser visualizados em 5 minutos. O número de vermes móveis e o número total de vermes serão usados para calcular a proporção de vermes móveis. A duração do ensaio pode mudar dependendo do objetivo da tela.
- Calcule a proporção de vermes móveis. Nas telas de D. dipsaci, os poços que produziram 0% de worms móveis de forma reprodutível são categorizados como acertos fortes.
nota: A exposição prolongada de placas no estágio de microscópios de dissecção é evitada porque a fonte de luz pode aquecer as placas e induzir efeitos variáveis no bioensaio.
