Ensaio de mineralização in vitro: um método colorimétrico para quantificar depósitos de cálcio osteoblástico em substituto de enxerto ósseo por coloração e extração de vermelho de alizarina S

Resumo

Fonte: Kampleitner, C. et al. Perfil de Compatibilidade Biológica em Biomateriais para Regeneração Óssea. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, descrevemos um método para a detecção de depósitos de cálcio secretados por osteoblastos usando um corante aniônico, Vermelho de Alizarina S. Os osteoblastos cultivados são primeiro corados e, em seguida, o corante é recuperado para quantificação colorimétrica dos depósitos de cálcio ou do grau de mineralização dos osteoblastos.

Protocolo

1. Ensaio de mineralização de osteoblastos

1. Pré-incubar discos de fosfato β-tricálcico (β-TCP) de 14 mm de diâmetro em 1 mL de meio de crescimento ósseo (BGM) em uma placa de cultura de suspensão de 24 poços a 37 ° C e 5% de CO₂ por 24 h antes de adicionar os osteoblastos (OBs). Use placas de cultura de tecidos padrão para controles e placas de cultura de suspensão para as amostras de biomaterial para evitar a fixação das células ao plástico.
2. Aspire o meio de pré-incubação e, em seguida, ressuspenda os OBs primários de camundongos no BGM. Adicione 8,8 x 10⁴ OBs/cm² aos discos β-TCP pré-incubados em uma placa de cultura de suspensão de 24 poços e, para o grupo controle, em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços (1 mL/poço). Os OBs serão anexados à placa de cultura de tecidos ou à amostra de biomaterial.
3. Substitua o BGM por 1 mL de meio de mineralização osteogênica (MM) contendo BGM, 50 μg / mL de ácido ascórbico e 5 mM de β-glicerofosfato 24 h após a adição dos OBs e incube por 14 dias a 37 ° C e 5% de CO₂. Troque o meio a cada 2-3 dias com 1 mL de MM recém-preparado para cada poço.

2. Mineralização de osteoblastos avaliada por coloração com Vermelho de Alizarina S (ARS)

1. Aspire o meio de cultura dos poços contendo OBs primários 14 dias após a adição de MM e enxágue duas vezes com 0,5 mL de 1x PBS em RT. Aspire o PBS e fixe as células adicionando 0,5 mL da solução de formalina tamponada a 10% em RT por 10 min.
2. Aspire a formalina tamponada a 10% com uma pipeta descartável e lave duas vezes com 0,5 mL de água ultrapura.
3. Aos OBs fixos, adicione 0,25 mL de solução de coloração ARS 40 mM (pH 4,2) dissolvida em água ultrapura e incube a placa em RT por 10 min em um agitador a 100 shakes / min.
4. Aspire a solução de coloração com uma pipeta de uso único e enxágue com 1 mL de água ultrapura. Repita esta etapa de 5 a 10 vezes para remover manchas inespecíficas.
   nota: A solução de enxágue deve ser sem cor.
5. Aspire a água ultrapura e adicione 1 mL de PBS frio. Incubar a placa em RT durante 10 min num shaker a 100 batidos/min.
6. Aspire o PBS, transfira os discos β-TCP corados para um novo poço e escaneie as placas com um scanner de mesa para registrar a mineralização.
7. Adicione 0,25 mL de solução de cloreto de cetilpiridínio a 10% e incube a placa em RT por 15 min em um agitador a 100 shakes / min para extrair o corante ARS.
8. Transfira os sobrenadantes para um tubo de 1,5 mL e centrifugue a 17.000 x g por 5 min em RT.
9. Adicione solução de cloreto de cetilpiridínio a 10% aos extratos com uma proporção de diluição de 1:10–1:20 e adicione as amostras (300 μL) em uma placa de 96 poços, incluindo dois poços em branco contendo apenas 10% de cloreto de cetilpiridínio.
10. Prepare 7 padrões de referência ARS variando de 4 a 400 μM diluindo a solução de coloração ARS 40 mM (pH 4,2) com solução de cloreto de cetilpiridínio a 10% para gerar uma curva padrão.
11. Adicione 300 μL do padrão de referência em duplicatas à placa de 96 poços.
12. Ler a absorvância das amostras, dos brancos e dos padrões de referência a 520 nm.
13. Subtraia as leituras em branco dos padrões de referência e leituras de amostra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Discos de fosfato β-tricálcico (β-TCP, 14 mm)			Os discos foram sinterizados em mufla a uma temperatura de 1150 °C. As amostras foram irradiadas com UV (15 min para cada lado) antes de serem usadas em culturas de células
Vermelho de alizarina S	Sigma-Aldrich	Rolamento A5533
Meio de crescimento ósseo (BGM)			α-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina/estreptomicina
Solução de formalina tamponada neutra a 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Cloreto de hexadecilpirdínio (cetilpiridínio) mono-hidratado	Sigma-Aldrich	C9002
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratado	Sigma-Aldrich	Rolamento A8960
Meio alfa MEM (α-MEM)	Tecnologias Gibco Life	11900-073
Meio de mineralização osteogênica (MM)			α-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina-estreptomicina + 50 μg/mL de ácido ascórbico + 5 mM de β-glicerofosfato
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	Pág. 4333
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-glicerofosfato de hidrato de sal dissódico	Sigma-Aldrich	G5422
Água ultrapura: água de cultura de células livre de pirogênio	VWR	L0970-500
Placa transparente de 96 poços	Greiner bio-one	655001
Placa de cultura de suspensão de 24 poços	Greiner bio-one	662102
Placa de cultura de tecidos com 24 poços	Greiner bio-one	Nº 662160
Centrífuga: VWR Mega Star 600R	VWR
Incubadora de CO2: HeraCell 240	Thermo Científico
Scanner de mesa: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Leitor de microplacas Infinite M200 Pro	Tecano
Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mL	VWR	Rolamento 21008-959
Incubadora agitada GFL3032	Inglês	3032
Pipeta descartável: pipeta de soro	Greiner bio-one	612301