1. Preparando grânulos para implantação de gel
- Faça uma cultura contendo esferas microtransportadoras revestidas com células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e pericitos.
- Examine os pratos contendo os grânulos revestidos com microportadores sob o microscópio usando a objetiva 20X para garantir que todos os grânulos tenham sido suficientemente revestidos por células endoteliais.
- Pipetar vigorosamente a solução de células em placas para as separar da placa de 6 cm e colocar a solução num tubo. Lave a placa 2X vezes adicionais com mídia completa e transfira para o tubo para coletar todos os grânulos residuais que possam estar aderidos à placa.
- Evite a introdução de bolhas de ar e use uma pipeta p1000 para minimizar a tensão de cisalhamento nas esferas revestidas de células endoteliais.
- Aguarde 3 minutos para permitir que os grânulos da solução assentem no fundo do tubo.
- Remova o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o grânulo usando uma ponta de pipeta p1000 (não use um aspirador a vácuo).
- Adicione 1 mL de meio completo a cada tubo e ressuspenda os grânulos.
- Aguarde 30-60 s para permitir que as contas assentem no fundo. Em seguida, remova o máximo possível do sobrenadante usando uma pipeta P1000 sem perturbar o grânulo do grânulo. Não use um aspirador a vácuo, pois a probabilidade de remover acidentalmente o pellet do grânulo aumenta muito.
- Repita as etapas 1.6 e 1.7 mais duas vezes. O objetivo é remover o máximo possível do HUVEC flutuante que pode ter sido destacado da placa de 6 cm, sem remover muitos grânulos revestidos com HUVEC, que devem se depositar nos tubos de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de fundo redondo mais rapidamente do que as células flutuantes.
- Adicione 1 mL de meio completo às contas.
2. Incorporação de contas revestidas em um gel de fibrina
- Remova o máximo de mídia possível sem perturbar o grânulo em cada tubo FACS usando uma pipeta P1000.
- Ressuspenda os grânulos em 2,5 ml de solução de fibrinogénio.
- Pipete 13 μL de solução de trombina em cada poço desejado de uma placa com fundo de vidro de 24 poços. O revestimento em uma placa com fundo de vidro é essencial para permitir a obtenção de imagens ideais dos brotos.
NOTA: Não deixe a trombina em um poço por mais de 5 a 10 minutos antes da próxima etapa.
- Adicione 0,5 mL de solução de grânulo/fibrinogênio a cada poço.
- Certifique-se de ressuspender bem a solução de esferas antes de pipetar a solução a cada vez.
- Tome cuidado para pipetar cuidadosamente diretamente na trombina já presente no poço. Pipete lentamente para cima e para baixo 2-3 vezes para misturar bem a solução, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar.
- Certifique-se de trocar a ponta da pipeta entre os poços.
- Tome cuidado para não mover ou perturbar a placa em nenhum momento durante a coagulação inicial da fibrina, pois qualquer movimento pode interromper a formação do gel.
- Deixe o prato no exaustor por 30 min em temperatura ambiente.
- Transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora a 37 °C por mais 1,5-2 h para permitir que o gel solidifique completamente
3. Revestimento de fibroblastos em cima do gel de fibrina
- Durante os últimos 30 minutos de solidificação do gel, retire os fibroblastos pulmonares humanos normais (NHLF) da seguinte forma:
- Lave um frasco T175 de células com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicione 5 ml de solução de descolamento celular e incube a 37 °C durante 10 min.
- Ressuspender NHLF na concentração de 20.000 células/mL em meio completo.
NOTA: As células NHLF podem ser cultivadas com Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de estreptomicina de penicilina.
- Coloque 1 mL da suspensão de células NHLF no gel de cada poço e coloque-o de volta na incubadora.
- Troque a mídia completa a cada dois dias durante o ensaio.
