1. Ensaio de contato larval (dose de ponto único ou ensaio de resposta à dose)
NOTA: O ensaio pode ser realizado com produtos químicos solúveis em água ou dimetilsulfóxido (DMSO), desde que a concentração final de DMSO nos poços de teste não exceda 1%. Solventes alternativos podem ser uma opção, mas é essencial primeiro confirmar que a concentração final não causa mais de 10% de mortalidade em 72 h após a exposição. O ensaio pode ser realizado como um ensaio de dose de ponto único ou dose-resposta. Se realizar o último, recomenda-se testar uma faixa de concentrações (mínimo de cinco), abrangendo o CL50 esperado.
- Rotule os poços de uma placa de tecido transparente de 24 poços.
- Preparar uma solução de reserva da química de ensaio num tubo de 1,5 ml.
- Pese cada produto químico usando uma balança analítica e, dependendo das características de solubilidade, ressuspenda em ddH2O estéril, DMSO ou outro solvente orgânico adequado de sua escolha.
nota: Os cálculos devem levar em consideração a pureza da química. Por exemplo, para uma química 99% pura, dissolva 10,1 mg em 1.000 μL de acetona para obter uma solução a 1%. Fechar com película de parafina e conservar a -20 °C.
- Determinar a concentração final da substância química de ensaio que será avaliada e preparar as diluições em série a partir da solução-mãe em conformidade, utilizando o solvente adequado.
nota: A concentração e o volume da química e do solvente podem ser calculados usando a fórmula C1*V1=C2*V2 onde C1=concentração da amostra 1, C2=concentração da amostra 2, V1=volume da amostra 1 e V2=volume da amostra 2.
- Preparar uma solução-mãe a 10 mM e diluições seriadas conforme necessário para obter as concentrações de ensaio desejadas (quadro 1B).
- Usando uma pipeta de transferência de plástico de calibre largo, transfira cinco larvas L3 para o poço de uma placa de teste de cultura de tecidos; As larvas L3 podem ser reconhecidas pelo comprimento (~ 2,5 - 3,5 mm) e largura da cápsula da cabeça de ~ 0,025 mm. Remova suavemente a água com uma pipeta de 1 mL e substitua-a pelo volume desejado de ddH2O. Repita para obter n = 4 réplicas técnicas por tratamento (ou seja, 20 larvas no total por tratamento).
- Adicione o volume apropriado de química de teste a cada um dos quatro poços replicados na placa de teste de 24 poços e gire suavemente a placa para garantir uma mistura uniforme da química. Coloque a placa em uma câmara de teste ou de crescimento sob condições constantes (por exemplo, recomenda-se 25 °C e ~ 75-85% de umidade relativa e um ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão, se possível).
nota: Para reprodutibilidade entre experimentos, certifique-se de que os ensaios subsequentes sejam realizados nas mesmas condições ambientais.
- Registre o número de larvas mortas / não responsivas em cada poço em 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 e 72 h após a exposição (ou pontos de tempo alternativos) na folha de pontuação (Tabela 2). Bata suavemente na lateral do prato. Se nenhum movimento for observado, toque suavemente a larva com um palito estéril. Pontue as larvas que não respondem ao toque/toque como "mortas".
nota: Outros fenótipos morfológicos e comportamentais podem ser observados e podem ser registrados.
- Corrija para controlar a mortalidade usando a fórmula de Abbott modificada, se desejado, da seguinte forma:
Mortalidade (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
onde X = a porcentagem de mortalidade na amostra tratada e Y = a porcentagem de mortalidade no controle.
- Faça um gráfico dos resultados como um histograma ou curva logarítmica usando o software de sua escolha, como o Graph-pad Prism 6 ou similar, e calcule os valores de Concentração Letal (LC) em relação ao controle.
- Repita o ensaio usando um lote separado de mosquitos para obter n = 3 ou mais réplicas biológicas.
Tabela 1. Exemplos de cálculos para o ensaio de dose de ponto único de larvas L3 de Aedes aegypti (A) e (B) ensaio de dose-resposta.
| A. Ensaios de dose única com três produtos químicos |
| química | Concentração (400 uM) |
| Amitriptilina | 80 mM Estoque: 2 mg de amitriptilina X 98% (pureza do pó) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/313,86 g X 1 L/0,08 mol X 10,6 μL/L = 78,06 μL de água. |
| Diluições seriais: Dilua o estoque 1:2 com ddH2O e depois 1:4 para atingir 10 mM. Adicione 40 μL de estoque de 10 mM ao poço contendo 960 μL de ddH20 para atingir uma concentração final de 400 μM/poço. Prepare diluições seriadas de estoque de 10 mM 1:2 para atingir estoques de 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM e 0,625 mM. |
| Cis-(z)-flupentixol | 80 mM Estoque: 2 mg de cis(z)flupentixol X 98% (pureza do pó) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/507,44 g cis(z)flupentixol X 1L/0,08 mol X 10,6 μL/L = 48,28 μL de água. |
| Diluições em série: Como acima. |
| Amitraz | 80 mM Estoque: 2 mg de Amitraz X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g de amitraz X 1 L/0,08 mol X 10,6 μL/1 L = 85,21 μL de DMSO (nota: Amitraz é solúvel apenas em DMSO). |
| Diluições em série: Como acima. |
| B. Dose-resposta |
| Química | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM |
| por exemplo, amitriptilina, cis-(Z)-flupentixol oramitraz | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| Estoque de 10 mM | Estoque de 5 mM | Estoque de 2,5 mM | Estoque de 1,25 mM | Estoque de 0,625 mM |
Tabela 2. Exemplo de folha de pontuação usada para registrar dados do ensaio de dose-resposta de larvas de mosquito. Controle, somente água ou água com 1% de DMSO ou outro solvente apenas. As doses típicas usadas para testar produtos químicos antagonistas de moléculas pequenas, como a amitriptilina, são 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM e 400 μM.
| Ensaio Larval de Mosquito L3 |
| Data de início: |
| Investigador: |
| Espécie/Cepa: |
| Tipo de ensaio: Dose de ponto único/resposta à dose |
- Mortalidade (nº de mosquitos mortos)
| | |
| Tempo (horas) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| algarismo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Porcentagem de mortalidade
|
| Tempo (horas) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| algarismo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
