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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Cultura de Mosquitos Adultos
NOTA: Cepas de mosquitos suscetíveis a inseticidas estão disponíveis no Repositório de Pesquisa e Referência de Reagentes da Malária. As cepas recomendadas são as seguintes: cepa Aedes aegypti Liverpool (LVP), cepa Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) e cepa Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Cultivar larvas de mosquito a partir de ovos em um ciclo de 12 h dia/12 h noturno a 28 °C e 75-85% de umidade relativa (UR) em bandejas plásticas de 25 cm x 40 cm (~ 400 larvas por bandeja) conforme descrito por Nuss. Alimente as larvas com gerbilo moído (A. aegypti e An. gambiae) ou ração para peixes em flocos (C. quinquefasciatus). Para ensaios larvais, colete larvas no estágio de terceiro ínstar larval (L3).
- Criar mosquitos adultos de pupas que foram transferidas para copos plásticos e colocá-los dentro de gaiolas plásticas de 20 L em um insetário nas condições descritas acima. Mantenha os mosquitos com solução de açúcar a 20%, conforme descrito em outro lugar. Colete adultos 3-5 dias após a emergência.
2. Ensaio tópico para adultos (dose de ponto único ou ensaio de resposta à dose)
NOTA: O ensaio tópico adulto é realizado usando acetona como solvente. Solventes alternativos podem ser uma opção, mas é essencial primeiro confirmar que a concentração final não causa mais de 10% de mortalidade 48 h após a exposição. O ensaio pode ser realizado como um ensaio de dose de ponto único ou dose-resposta e é usado para determinar a dose letal (LD). Se realizar o último, recomenda-se testar uma faixa de concentrações (mínimo de cinco), abrangendo o LD50 esperado.
- Determine o número de mosquitos fêmeas adultas necessários para completar o ensaio.
nota: Um ensaio de dose pontual com uma única química exigirá um mínimo de 90 mosquitos (30 para o controle positivo, 30 para o controle negativo somente com acetona e 30 para a química de teste).
- Cultive mosquitos fêmeas adultas de 3 a 5 dias de idade e mova para um balde plástico separado de 20 mL usando um aspirador (Figura 1).
- Rotule os copos de papel de 9 onças com o nome e a concentração da química de teste. Separe quadrados de malha de 10 cm x 10 cm e elásticos para cada copo (veja a Figura 2).
- Selecione um inseticida existente como controle positivo (por exemplo, o piretróide sintético, bifentrina) e prepare uma solução estoque a 1% (10 μg/μL) em acetona.
NOTA: Os cálculos devem levar em consideração a pureza da química. Por exemplo, para uma química 99% pura, dissolva 10,1 mg em 1.000 μL de acetona para obter uma solução a 1%. Fechar com película de parafina e conservar a -20 °C.
- Utilizando o mesmo procedimento acima, preparar uma solução-mãe da substância química de ensaio.
nota: Muitos produtos químicos de teste são altamente lábeis e as soluções devem ser preferencialmente frescas cada vez que o bioensaio é realizado.
- Preparar diluições em série do controlo positivo e testar produtos químicos a partir de soluções-mãe, como indicado na figura 3, utilizando frascos de vidro de 20 ml previamente enxaguados com acetona.
- Purgue uma seringa de vidro de 1 mL com acetona, encha com acetona e prenda no microaplicador ajustado para fornecer um volume de 0,25 μL.
- Trabalhando em lotes de dez, remova mosquitos fêmeas adultas de 3 a 5 dias de idade das gaiolas usando um aspirador e anestesiar por até cinco minutos a 4 ° C na geladeira ou no gelo. Em seguida, transfira os mosquitos para uma placa de Petri e coloque no gelo por até 10 min.
- Trabalhando rapidamente, remova uma única fêmea com uma pinça fina e aplique 0,25 μL de solução de teste no tórax dorsal usando o microaplicador de seringa. Confirme a entrega da química por observação usando um microscópio de dissecação para garantir que cada mosquito receba o volume apropriado de química de teste.
- Transfira o mosquito para um copo de papel rotulado apoiado no gelo e repita nove vezes para obter n = 10 mosquitos tratados. Sele os mosquitos no copo com um quadrado de malha preso com um elástico e transfira para uma banheira de plástico ou câmara de crescimento sob condições constantes de 28 ° C e 75-85% UR (em um ciclo de 12 h dia / 12 h noite é preferível).
- Repita o experimento acima duas vezes para obter n = 3 réplicas técnicas (ou seja, 30 mosquitos no total) por grupo de tratamento ou controle.
- Repita as etapas 2.7 a 2.10 primeiro com a química de teste e depois com o controle positivo.
nota: Outro controle útil a ser incluído se houver mosquitos suficientes disponíveis é um "blank" de 30 mosquitos anestesiados que não recebem química de teste ou solvente.
- Registre o número de mosquitos "mortos/não responsivos" em 30 min, 60 min, 2, 24 e 48 h após a exposição (ou pontos de tempo alternativos) usando a folha de pontuação (Tabela 1). Classifique os mosquitos como "mortos/não responsivos" se eles apresentarem falta de movimento, definida como deitados de lado ou de costas e com incapacidade de voar.
- Se desejar, corrija para controlar a mortalidade usando a fórmula de Abbott modificada da seguinte forma:
Mortalidade (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
onde X = a porcentagem de mortalidade na amostra tratada e Y = a porcentagem de mortalidade no controle.
- Exiba os resultados como um histograma ou uma curva exponencial. Para um ensaio dose-resposta, calcule o valor LD50, LD 75 ou LD90 para a química de teste em relação ao controle.
- Repetir o ensaio pelo menos duas vezes utilizando lotes separados de mosquitos para obter n = 3 ou mais réplicas biológicas.
