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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Ensaio de alimentação sanguínea em adultos (dose de ponto único ou ensaio de dose-resposta)
- Colete aproximadamente 150 mosquitos fêmeas adultas de 4 a 5 dias e transfira para uma gaiola separada. Repita para obter 6 gaiolas se estiver realizando um ensaio dose-resposta. Remova a fonte de açúcar 1-24 h antes do ensaio de alimentação.
- Preparar uma solução-mãe de química conforme descrito acima, tendo em conta a pureza da química (uma solução de reserva típica é de 80 mM em tampão água ou sal) e, em seguida, preparar diluições em série em água/tampão, conforme necessário.
- Adicionar 40 μl de cada uma das diluições a 960 μl de sangue de coelho desfibrinado para obter a concentração de ensaio desejada. Aplique o filme de membrana em uma unidade de alimentação e sele com um anel de borracha. Transfira 1 mL de sangue via pipeta e conecte a unidade de alimentação a uma unidade de aquecimento.
- Limpe suavemente a superfície da membrana com solução de ácido lático a 10% recém-feita e coloque a unidade de alimentação na gaiola de mosquitos adultos. Cubra a gaiola com um pano escuro ou saco de lixo preto e deixe os mosquitos se alimentarem por uma hora.
- Repita as etapas 1.2 - 1.4 para o restante das soluções de teste e o controle negativo (somente sangue).
- Após a conclusão da alimentação, coloque baldes a 4 ° C na geladeira por 5 min para anestesiar os mosquitos. Remova os mosquitos machos e as fêmeas não alimentadas e conte e registre o número total de mosquitos alimentados e parcialmente alimentados por meio do exame do abdômen.
- Reter mosquitos fêmeas parcial e totalmente alimentados, visando um mínimo de 50 mosquitos alimentados com sangue por dose.
- Transfira os baldes para uma cuba de plástico ou câmara de crescimento sob condições constantes de 28 °C e 75 - 85% RH (em um ciclo de 12 h dia/12 h noturno é preferível).
- Registre o número total de mosquitos mortos/não responsivos em 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 e 72 h (ou pontos de tempo alternativos, conforme desejado) usando a folha de pontuação (Tabela 1).
- No terceiro dia após a alimentação com sangue, introduza um copo de ovos na gaiola e colete os ovos por um período de 72 horas. Contar o número total de ovos produzidos por tratamento ao microscópio de dissecação.
- Calcule a porcentagem de mortalidade e fecundidade em função do número total de mosquitos alimentados para cada grupo de tratamento e o controle. Corrija a mortalidade de controle usando a fórmula de Abbott modificada, se desejado.
- Exiba dados de toxicidade e fecundidade como um gráfico de histograma ou curva exponencial (se estiver realizando um ensaio de dose-resposta) usando o software de sua escolha. Se realizar um ensaio dose-resposta, calcule o valor LD50, LD75 ou LD90 para a química de ensaio em relação ao controlo.
- Repetir o ensaio pelo menos duas vezes utilizando lotes separados de mosquitos para obter n = 3 ou mais réplicas biológicas.
Tabela 1. Exemplo de folha de pontuação usada para registrar dados do ensaio de alimentação de sangue adulto.As doses típicas usadas para testar produtos químicos antagonistas de moléculas pequenas, como a amitriptilina, são 50 μM, 100 μM, 200 μM e 400 μM.
| Mosquito adulto (3-5 dias de idade) Ensaio tópico |
| Data de início: |
| Investigador: |
| Espécie/Cepa: |
| Tipo de ensaio: Dose de ponto único/dose-resposta |
| A. Mortalidade (nº de mosquitos mortos) |
| Tempo (horas) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| algarismo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| B. Porcentagem de mortalidade |
| Tempo (horas) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Controle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| algarismo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |