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1. Produção de lentivírus
NOTA: A produção e manipulação de vetores lentivirais foi realizada de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) para pesquisas envolvendo DNA recombinante. O plasmídeo que codifica o tipo selvagem e o mutante A4V SOD1 marcado com YFP aprimorado (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP) são usados. Ambos os produtos de fusão gênica foram amplificados usando o par de primers de PCR 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGTGC-3′ e 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′ e inseridos no plasmídeo pTRIP-delta U3 CMV usando locais de restrição XhoI e BsrGI. Evitar mais de 20 passagens e manter as células com menos de 60% de confluência ajuda a garantir uma boa eficiência de transfecção.
- No Dia 1, divida as células HEK-293T em 30 - 40% de confluência em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro (3 x 10⁶ células/prato) em 10 mL de meio de cultura de células (DMEM com alto teor de glicose com 10% de FBS e 4 mM de L-glutamina) para produção de vírus.
- Mantenha a placa de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro em uma incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂) durante a noite.
- No dia 2, prepare uma solução de transfecção de DNA contendo 10 μg de vetores lentivirais (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP ou -SOD1A4V-YFP) junto com os plasmídeos de empacotamento lentiviral (5 μg de pVSVg; 10 μg de pCMV-dR8.71) (Figura 1A). Adicione 125 μL de CaCl₂ 1 M e ajuste o volume para 500 μL usando água destilada. Adicione suavemente 500 μL de HEPES 0,05 M à mistura e incube por 10 min em temperatura ambiente.
- Substitua o meio de células HEK-293T por 10 mL de meio de cultura fresco pré-aquecido sem antibióticos misturado com 1 mL de solução de transfecção de DNA e incube durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂.
- No dia 3, substitua o sobrenadante celular por meio de cultura fresco.
- No dia 4, colha o sobrenadante em um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 500 x g para remover as células mortas e detritos. Purifique ainda mais o sobrenadante passando-o por um filtro de 0,45 μm usando uma seringa grande de 60 mL. Dispensar imediatamente em alíquotas descartáveis (300 μL) e conservar a -80 °C. Para manter a atividade máxima do produto, evite um ciclo de congelamento e descongelamento.
2. Transdução lentiviral
- Divida a linhagem celular a ser infectada em 60% de confluência (células HEK-293 e SH-SY5Y; 5 x 10⁵ células por poço e U2OS; 1 x 10⁵ células por poço) em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em 2 mL de meio DMEM suplementado com 10% de FBS.
- Mantenha a placa de cultura de tecidos de 6 poços em uma incubadora a 37 °C a 5% de CO₂ durante a noite.
- Retirar o lentivírus congelado do congelador a -80 °C e descongelar uma alíquota sobre gelo antes de cada utilização; não voltar a congelar.
- Enquanto o vírus está descongelando, aqueça o meio de cultura celular que contém o soro compatível com a linhagem celular de interesse. Assim que o vírus estiver totalmente descongelado, prepare uma série de diluições (1:3, 1:10, 1:30 e 1:100) em DMEM em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Aumente o volume nos tubos para 1 mL com meio de soro reduzido.
- Adicione 2 μL de Polybrene (a um estoque de 4 μg/μL) a 1 mL de vírus/meio. Misture bem pipetando e adicione 1 mL de mistura às células. Incubar as células com o vírus durante 24 h.
- Remova a mídia do vírus e substitua por mídia DMEM normal suplementada com 10% de FBS. Mantenha as células a 37 °C, 5% de CO₂.
- Monitore o crescimento das células e troque os meios de cultura a cada dois dias. Na confluência, expanda a placa de 6 poços em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro.
- Uma vez que as células tenham sido suficientemente expandidas, semeie 1,5 x 10⁴ células por poço em 50 μL de meio DMEM em placas de ensaio de 384 poços para verificar o nível de expressão da proteína marcada com YFP por microscopia. Se a expressão da célula proteica marcada com YFP mostrar uma relação sinal-ruído ≥3, prepare o estoque de células para a linha celular correspondente.
3. Efeito dependente do tempo do inibidor de proteassoma na agregação de proteínas
NOTA: Execute a aquisição de imagens usando um microscópio automatizado (consulte Materiais).
- Dispense 0,25 μL de DMSO ou inibidor de proteassoma dissolvido em DMSO 100% (ALLN, 2 mM) em placas de fundo plano de 384 poços.
- Semeie manualmente 1,5 x 104 células por poço em 50 μL de meio DMEM na mesma placa de ensaio. A concentração final do inibidor do proteassoma (ALLN) deve ser de 10 μM.
- Configure a unidade de controle ambiental do sistema de microscópio a 37 °C e 5% de CO₂. Uma captura de tela da configuração experimental é mostrada na Figura 2.
- Opere o microscópio no modo de fluorescência de campo amplo, usando o software com as seguintes configurações: objetiva LWD 20X, modo não confocal, 4 campos/poço, com intervalo de captura de uma hora. No final de cada execução, as imagens capturadas são carregadas automaticamente no servidor.
4. Imagem de lapso de tempo para expressão de YFP em células vivas e análise de imagem (canal único)
NOTA: As etapas a seguir descrevem a aplicação do software (por exemplo, Columbus).
- Selecione o algoritmo apropriado para segmentar os objetos primários (citosol e agregados). Se necessário, ajuste o limite de fundo e os parâmetros de contraste (Figura 3).
- Conte as células usando 'localizar células' com um limite individual de 0,1 para o canal de intensidade YFP. Determine agregados usando um algoritmo de 'localização de pontos' com uma intensidade relativa de pontos YFP >0,2 e um coeficiente de divisão de 1,0.
5. Efeito da resposta à dose de inibidores de proteassoma na agregação de proteínas em células vivas coradas para seus núcleos (dois canais)
NOTA: Execute a aquisição de imagens usando um microscópio automatizado. Determine a faixa de concentração dos inibidores de proteassoma (ALLN, Epoxomicina e MG132) com base no valor esperado de IC50 para garantir um ajuste ideal da curva.
- Prepare diluições seriais de compostos em uma placa de polipropileno de armazenamento de 384 poços pela série de diluição padrão de 1:3. Certifique-se de misturar bem as diluições do composto para garantir que as concentrações do composto sejam precisas.
- Dispense 0,25 μL de inibidores de proteassoma em placas de ensaio pretas vazias de fundo plano de 384 poços. Utilizamos um manipulador de líquidos equipado com uma cabeça capilar de 384 capaz de transferir volumes.
- Semeie 1,5 x 1010⁴ células por poço em 50 μL de mídia DMEM em placas de ensaio. Incubar as placas de ensaio a 37 °C e 5% de CO₂ durante 24 h.
- Adicione 10 μL de meio DMEM (pré-aquecido a 37 °C) com solução de coloração (Hoechst 33342 a um estoque de 10 mg / mL) e incube em temperatura ambiente por 10 min.
- Inicie o software operacional do microscópio. Uma captura de tela da configuração experimental é mostrada na Figura 4. Selecione a guia "Configuração" e selecione a objetiva 20X e o tipo de placa correto. Certifique-se de que o "colarinho" esteja definido com o valor correto na objetiva, permitindo o foco adequado com diferentes tipos de placas.
- Selecione a guia "Microscópio". Defina a exposição 1 como YFP (laser 488) e a exposição 2 como Hoechst (laser 405). Ative o filtro em ambas as exposições e atribua a exposição 1 à câmera 1 e a exposição 2 à câmera 2. Defina os tempos de exposição para ~800 ms para a exposição 1 e ~40 ms para a exposição 2.
- Selecionar exposição 1. Defina a altura de focagem para 0 μm. Selecione "Focagem". Uma vez focado, exponha a câmera 1. Ajuste a altura do foco para otimizar o plano de exposição e clique em "Tirar altura". Altere os tempos de exposição e a potência do laser para obter uma intensidade máxima de pixel de ~ 3.000. Salve os parâmetros de exposição. Repita para a exposição 2.
- Selecione a guia "Definição do experimento". Crie um layout e um sublayout. Arraste e solte o layout, a exposição, a imagem de referência, o arquivo de corte inclinado e o sublayout relevantes. Salve o experimento.
- Selecione a guia "Experimento automático" e adquira imagens. No final de cada execução, as imagens capturadas são carregadas automaticamente no servidor.
6. Análise de imagem de imagens de dois canais
- Selecione o algoritmo do software para segmentar os objetos primários (núcleos, citosol e agregados) (Figura 5).
- Selecione o método que segmenta os núcleos com precisão por inspeção visual dos objetos segmentados. Objetos corados com Hoechst no canal 1 (Ch1) serão usados para determinar o número de células. A coloração YFP do mutante SOD1-A4V no canal 2 (Ch2) será usada para determinar a quantidade de agregados.
- Conte as células usando o algoritmo 'encontrar núcleos' como regiões de coloração de Hoechst >20 μm², com um fator de divisão de 7,0, um limiar individual de 0,40 e um contraste >0,10.
- Crie a tabela de dados e determine EC50 para cada um dos compostos usando a equação de 'Regressão não linear' no software gráfico.
