Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Ensaio de Atividade de Endotoxina (EAA)
- Colete amostras de sangue do paciente em tubos estéreis contendo anticoagulante EDTA. Armazene amostras de sangue em temperatura ambiente
- Prepare os tubos de ensaio EA para cada amostra de sangue do paciente que você precisa testar. Coloque os tubos em racks de tubos. Em seguida, remova as tampas.
- Cada teste de EA consiste em 5 tipos diferentes de tubos; use cada um para uma parte diferente do teste (consulte as próximas etapas).
- Use o tubo # 1 (o tubo "Controle") para medir a atividade basal da explosão oxidativa não específica dos neutrófilos do paciente na ausência de um anticorpo específico.
- Use o tubo # 2 (o tubo "Amostra") para medir a explosão oxidativa em resposta ao complexo de anticorpos lipopolissacarídeo (LPS).
- Use o tubo # 3 (o tubo "Max") para medir a explosão oxidativa máxima dos neutrófilos do paciente em resposta a um excesso de endotoxina.
- Use o tubo # 4 (o tubo "LPS") como fonte de endotoxina exógena.
- Use o tubo #5 (tubo "Alíquota") para armazenamento de sangue.
NOTA: Duplicatas dos tubos # 1, # 2 e # 3 são fornecidas para um total de 8 tubos a serem usados para cada amostra de sangue que está sendo testada (o frasco de reagente EA e o teste de controle de qualidade podem ser usados para todos os testes contidos em uma bolsa).
- Usando uma pipeta combinada, pipete um volume de 1 mL do reagente EA do frasco nos tubos #1 (tubo de controle), #2 (tubo de amostra) e #3 (tubo máximo), cada um em duplicata.
NOTA: Pipete pela lateral do tubo para evitar que a solução respingue.
- Misture a amostra de sangue do paciente invertendo suavemente o tubo de coleta de sangue 20 vezes. Em seguida, pipete 0,5 mL de sangue do paciente no tubo #4 (tubo LPS max) e no tubo #5 (tubo de alíquota). Tubo de vórtice #4 por 10 s.
- Coloque os racks de tubos com todos os tubos de ensaio EA no agitador da incubadora. Feche a tampa e incube por 10 min à temperatura de 37°C.
- Abra a tampa e remova os racks de tubos do agitador da incubadora. Tubo de vórtice #5 (tubo de alíquota). Usando uma ponta estéril, pipete 40 μL de sangue nos tubos # 1 e # 2, em duplicata.
- Tubo de vórtice #4 (tubo LPS). Usando a mesma ponta de pipeta, pipete 40 μL de sangue do tubo #4 para o tubo #3 (tubo Max), em duplicata.
- Vortex os seis tubos de ensaio finais (#1, #2, #3 e respectivas duplicatas) e coloque-os de volta em seus racks.
NOTA: Certifique-se de que todos os tubos estejam em vórtice pelo mesmo período de tempo.
- Coloque os suportes de tubos de volta no agitador de incubação e feche a tampa. Defina o agitador de incubação a 100 rpm e, em seguida, inicie o movimento por 14 min.
- Insira o cartão com chip rotulado pela EA no quimioluminômetro e pressione iniciar. Após a incubação de 14 minutos, siga as instruções exibidas no quimioluminômetro para ler os tubos EA na ordem correta.
- Agitar suavemente cada tubo durante 10 s antes de o colocar no suporte de amostras do quimioluminómetro. Abra a gaveta de amostras e coloque o tubo #1 no porta-amostras. Em seguida, feche a gaveta de amostras e aguarde a leitura da Unidade de Luz Relativa (RLU).
- Repita a etapa 1.12 para o tubo 2 e o tubo 3.
- Repita a etapa 1.12 para os tubos duplicados 1, 2 e 3.
nota: Tente vórtice todos os tubos pelo mesmo período de tempo durante as etapas 1.12 a 1.14.
- Depois que todos os tubos forem processados, observe que os resultados do EA serão calculados e impressos automaticamente. Os níveis são expressos em unidades EA e representam a média das determinações duplicadas das mesmas amostras.
- Repita as etapas 1.4 a 1.15 para cada amostra de sangue que precisa ser testada.
- Uma vez concluído o ensaio, armazene os tubos de ensaio restantes e os reagentes EA a 2–8 °C por até 30 dias.
