Ensaio de lisado de amebócitos Limulus turbidimétrico: uma técnica para detectar e quantificar a contaminação por endotoxinas em medicamentos nanoformulados

Resumo

Fonte: Neun, B. W. et al., Detecção de endotoxina em nanoformulações usando ensaios de lisado de amebócitos de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve o formato turbidimétrico do lisado de amebócitos Limulus, ou LAL, ensaio para estimar a contaminação por endotoxinas em nanoformulações de doxorrubicina lipossomal PEGilado. A turbidez da solução após a reação da endotoxina com o reagente LAL ajuda a estimar a endotoxina na amostra.

Protocolo

1. Preparação de amostras de nanopartículas

1. Preparar a amostra de estudo em água de qualidade LAL.
2. Se o pH da amostra estiver fora da faixa de 6 a 8, ajuste o pH usando hidróxido de sódio ou ácido clorídrico sem pirogênio.
3. Usando água de qualidade LAL, prepare várias diluições da amostra de estudo. Certifique-se de que a diluição mais elevada não excede a diluição máxima válida (MVD).

2. Preparação de reagentes comuns entre os formatos LAL

1. Diluir o estoque concentrado de hidróxido de sódio usando água reagente LAL isenta de pirogênio para preparar uma solução de trabalho na concentração de 0,1 N.
2. Diluir o estoque concentrado de ácido clorídrico usando água reagente LAL isenta de pirogênio e preparar uma solução de trabalho a uma concentração final de 0,1 N.
3. Preparação da Endotoxina Padrão de Controle (CSE)
   1. Reconstituir o CSE de acordo com o certificado de análise fornecido pelo fabricante.
      nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes sobre o número de catálogo e a aplicação de uma determinada formulação CSE em diferentes formatos LAL.
4. Preparação do reagente LAL
   1. Reconstituir o reagente LAL de acordo com o certificado de análise fornecido pelo fabricante.
      nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes sobre o número de catálogo e a aplicação de uma determinada formulação de reagente LAL em diferentes formatos LAL.

3. Ensaio de LAL de turbidez

1. Preparação dos padrões de calibração
   1. Usando 900 μL de água de grau LAL e 100 μL de CSE, prepare quantas diluições intermediárias forem necessárias para permitir a preparação de um padrão de calibração com uma faixa de concentração de 0,001 a 1 EU/mL.
   2. Primeiro rotule os tubos e adicione 900 μL de água de grau LAL em cada tubo. Em seguida, adicione 100 μL de solução de 10 EU/mL para preparar o padrão de calibração com concentração de 1EU/mL.
   3. Repita a diluição serial de 10 vezes conforme descrito acima para preparar três padrões de calibração inferiores. Verifique se quatro padrões de calibração variando de 0,001 a 1 UE / mL foram preparados.
2. Preparação dos Controles de Qualidade
   1. Prepare um controle de qualidade de 0,05 UE / mL combinando 50 μL da solução CSE de 1 UE / mL com 950 μL de água de grau LAL.
3. Preparação de controles de inibição/aprimoramento (IEC)
   1. Preparar o IEC com concentração de 0,05 UE/ml combinando 25 μl da solução de 1 UE/ml de CSE e 475 μl do nanomaterial de ensaio numa determinada diluição.
4. Procedimento experimental
   1. Deixe o instrumento aquecer ligando-o com aproximadamente 30 minutos de antecedência. Configurar o comprimento de onda de detecção para 660 nm, pois isso é apropriado para a turbidez LAL.
   2. Faça login digitando o nome de usuário e a senha.
   3. Abra o software (Tabela de Materiais) clicando no ícone correspondente na tela do computador.
   4. Selecione Coletar dados na tela inicial do software. Insira a ID de teste e as informações do grupo de dados no espaço correspondente na guia Geral na tela inicial.
   5. Clique na guia Hardware. Escolha o tipo de instrumento em um menu suspenso.
   6. Configurar o comprimento de onda de detecção para 660 nm, uma vez que tal é adequado para a turvação LAL, escolhendo o método de turvação LAL.
   7. Verifique se um número de série, ID do sistema e informações da porta serial aparecem na tela. Clique em OK. Clique em OK mais uma vez para confirmar.
   8. Insira a ID da amostra na mesma ordem em que a amostra é testada. Use os botões padrão para inserir o controle negativo, a curva padrão e as amostras de teste.
   9. Prepare tubos duplicados para cada amostra e adicione 200 μL (taxa de teste 4:1) ou 100 μL (taxa de teste 1:1) de controle negativo (água), padrões de calibração, controle de qualidade, IEC e nanopartículas de teste em tubos de vidro pré-rotulados.
   10. Adicione 50 μL (taxa de teste 4:1) ou 100 μL (proporção de teste 1:1) de reagente LAL ao primeiro frasco de teste, vortice-o brevemente e insira na ranhura de teste no carrossel de instrumentos. Se for utilizada a proporção de 1:1, o volume do reagente LAL é de 100 μL.
   11. Repita o procedimento descrito acima para outras amostras. Processe as amostras uma de cada vez.
        

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
hidróxido de sódio	sigma	S2770	Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8
ácido clorídrico	sigma	H9892	Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8
Reagente LAL	Associados de Cape Cod	T0051	Este reagente pode ser usado apenas com ensaio de turbidez
Padrão de controle de endotoxinas	Associados de Cape Cod	E0005	Este reagente pode ser usado com ensaios de turbidez e coágulo de gel
Água de grau LAL	Associados de Cape Cod	WP0501	Este reagente pode ser usado com qualquer formato LAL
Tampão Glucashield	Associados de Cape Cod	GB051-25	Usado para prevenir a resposta falso-positiva de beta-glucanos
Tubos de diluição de vidro descartáveis sem endotoxinas 12 x 75 mm	Associados de Cape Cod	TB240	Esses tubos podem ser usados com todos os três ensaios
Tubos de reação de vidro descartáveis sem endotoxinas 8 x 75 mm	Associados de Cape Cod	TK100	Esses tubos podem ser usados com ensaios de turbidez e cromogênicos
Ponteiras livres de pirogênio com volumes de 0,25 e 1,0 mL	CHUVA	PPT25, PPT10	Pontas e pipetas podem adsorver endotoxina e liberar lixiviáveis que interferem no ensaio de LAL. Essas ponteiras RAININ são usadas porque seu desempenho ideal no ensaio LAL foi verificado e confirmado
Tubos de microcentrífuga sem pirogênio, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Podem ser utilizados outros fornecimentos equivalentes
Compostos de taxa de pirogênio, 5mL	Eppendorf	30089669	Podem ser utilizados outros fornecimentos equivalentes
Repita o pipetador	Eppendorf	4982000020	Podem ser utilizados outros fornecimentos equivalentes
Microcetrifúgios	qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
Geladeira, 2-8 C	qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
vórtice	qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
Congelador, -20 C	qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
Leitor Pyros Kinetix ou Pyros Kinetix Flex	Associados de Cape Cod	PKF96	Outros instrumentos podem ser usados. No entanto, os reagentes LAL e os padrões de endotoxina usados neste ensaio podem exigir otimização. Quando outra instrumentação for usada, consulte os fabricantes do instrumento e do kit LAL para obter instruções