Ensaio de lisado de amebócitos de Limulus de coágulo de gel: um método para detecção de endotoxinas bacterianas em formulações de nanopartículas

Resumo

Fonte: Neun, B. W. et al., Detecção de endotoxina em nanoformulações usando ensaios de lisado de amebócitos de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve um ensaio de coágulo de gel para determinar a presença de endotoxinas bacterianas em nanoformulações usando lisado de amebócitos Limulus derivado das células sanguíneas de caranguejos-ferradura. O ensaio ajuda a testar a contaminação por endotoxinas de produtos farmacêuticos, incluindo formulações à base de nano.

Protocolo

1. Preparação de amostras de nanopartículas

1. Preparar a amostra de estudo em água de qualidade LAL.
2. Se o pH da amostra estiver fora da faixa de 6 a 8, ajuste o pH usando hidróxido de sódio ou ácido clorídrico sem pirogênio.
3. Usando água de grau LAL, prepare várias diluições da amostra do estudo. Certifique-se de que a diluição mais elevada não excede a diluição máxima válida (MVD).

2. Preparação de reagentes comuns entre os formatos LAL

1. Diluir o estoque concentrado de hidróxido de sódio usando água reagente LAL isenta de pirogênio para preparar uma solução de trabalho na concentração de 0,1 N.
2. Diluir o estoque concentrado de ácido clorídrico usando água reagente LAL isenta de pirogênio e preparar uma solução de trabalho a uma concentração final de 0,1 N.
3. Preparação da Endotoxina Padrão de Controle (CSE)
   1. Reconstituir o CSE de acordo com o certificado de análise fornecido pelo fabricante.
      nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes sobre o número de catálogo e a aplicação de uma determinada formulação CSE em diferentes formatos LAL.
4. Preparação do reagente LAL
   1. Reconstituir o reagente LAL de acordo com o certificado de análise fornecido pelo fabricante.
      nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o número de catálogo e a aplicação de uma determinada formulação de reagente LAL em diferentes formatos LAL.

3. Coágulo de gel LAL

NOTA: Este ensaio identifica a presença de endotoxinas na amostra com base na observação visual e detecção de um coágulo no tubo de reação. As etapas experimentais são descritas abaixo. Use uma folha de bancada para registrar os resultados. Esta folha de bancada não é obrigatória e outras formas de registrar os resultados do ensaio também são aceitáveis. Um exemplo de tal folha de bancada é fornecido em materiais suplementares para a conveniência de um leitor. Lambda (l) é a sensibilidade do ensaio de coágulo de gel e é de 0,03 UE/mL.

1. Rotule quantos tubos de reação forem necessários para acomodar o número de amostras de teste analisadas. Consulte a folha de bancada para obter detalhes sobre o número de réplicas usadas na etapa 1, etapa 2 e etapa 3 do ensaio.
2. Alíquota de 100 μL de água, controles ou amostra de teste por tubo.
3. Preparar o CSE de modo a que a concentração final seja igual a 4λ.
4. Combine 100 μL do padrão mencionado acima com 100 μL de água ou amostra de teste para atingir a concentração final de CSE de 2λ. Repita mais três vezes para obter lambda e meio-lambda e um quarto lambda.
5. Certifique-se de que a temperatura no banho-maria é de 37 °C.
6. Adicione 100 μL de lisado por tubo de ensaio, vortex brevemente e coloque o rack com todos os tubos no banho-maria por 1 h.
7. Inverta o tubo com um movimento suave.
8. Registre manualmente os resultados usando "+" (coágulo firme) ou "-" (sem coágulo ou coágulo solto) na folha de bancada.
9. Prossiga com a análise de acordo com a USP BET 85; use a folha de bancada como material de suporte.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente LAL	Associados de Cape Cod	G5003	Este reagente é específico para o ensaio de coágulo de gel
Padrão de controle de endotoxina	Associados de Cape Cod	E0005	Este reagente pode ser usado com ensaios de turbidez e coágulo de gel
hidróxido de sódio	sigma	S2770	Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8
ácido clorídrico	sigma	H9892	Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8
Água de grau LAL	Associados de Cape Cod	WP0501	Este reagente pode ser usado com qualquer formato LAL
Tampão Glucashield	Associados de Cape Cod	GB051-25	Usado para prevenir a resposta falso-positiva de beta-glucanos
Tubos de diluição de vidro descartáveis sem endotoxinas 12 x 75 mm	Associados de Cape Cod	TB240	Esses tubos podem ser usados com todos os três ensaios
Tubos de reação de vidro descartáveis sem endotoxinas 10 x 75 mm	Associados de Cape Cod	TS050	Esses tubos são para uso com o ensaio de coágulo de gel
Ponteiras sem pirogênio com volumes de 0,25 e 1 mL	CHUVA	PPT25, PPT10	Pontas e pipetas podem adsorver endotoxina e liberar lixiviáveis que interferem no ensaio de LAL. Essas ponteiras RAININ são usadas porque seu desempenho ideal no ensaio LAL foi verificado e confirmado
Tubos de microcentrífuga sem pirogênio, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Podem ser utilizados outros fornecimentos equivalentes
Compostos de taxa de pirogênio, 5mL	Eppendorf	30089669	Podem ser utilizados outros fornecimentos equivalentes
Repita o pipetador	Eppendorf	4982000020	Podem ser utilizados outros fornecimentos equivalentes
Microcetrifúgios	Qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
Geladeira, 2-8° C	Qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
vórtice	Qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
Congelador, -20 C	Qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada
Banho-maria, 37° C	Qualquer marca		Qualquer marca pode ser usada, no entanto, é importante desligar a circulação de água ou usar um banho-maria não circulante, pois o fluxo de água afetará a formação de coágulos e levará a resultados falso-negativos