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1. Ativação da placa do kit de ensaio
- Ative a placa do kit de ensaio do filtro de 96 poços (contendo CPH-xilana azul) (Lista de Materiais) adicionando 200 μl de solução de ativação (obtida com o kit) em cada poço, seguida de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente sem agitação.
- Aplique vácuo usando um coletor de vácuo (com o bloco espaçador dentro e qualquer placa padrão transparente de 96 poços como placa de coleta) para remover a solução de ativação existente. Também é possível usar uma centrífuga a 2.700 x g por 10 min para esta etapa em vez do coletor de vácuo.
- Lave os substratos de CPH adicionando 100 μl de água estéril e aplique um vácuo (ou força centrífuga) para remover o estabilizador. Repita esta etapa mais duas vezes e as placas estarão prontas para uso.
2. Reação enzimática
NOTA: Sempre inclua o tampão sozinho como controle negativo e, se possível, as enzimas previamente caracterizadas como controles positivos. Use um número estatisticamente apropriado de réplicas. Os substratos CPH são estáveis entre pH 3,0 a 10,0 e o volume total da solução enzimática final tampão em cada poço não deve exceder 180 μl. Extrato vegetal ou caldo de cultura também podem ser usados em vez de solução enzimática purificada.
- Adicione 150 μl de tampão acetato de sódio a 100 mM, pH 4,5 e 5 μl de solução de endocelulase (até uma concentração final de 1 U/ml) a cada alvéolo da placa do kit de ensaio.
- Coloque a placa do produto (uma placa de poço transparente compatível com o leitor de placa de microtitulação) embaixo da placa do kit de ensaio para coletar qualquer vazamento potencial da placa de reação durante a agitação.
- Incubar a placa do kit de ensaio a 25 °C por 30 min em um agitador horizontal a 150 rpm.
NOTA: Misturar a reação na placa do kit de ensaio durante a incubação é crucial para obter um resultado consistente e reprodutível. Os substratos CPH são estáveis até 90 °C. O tempo de incubação deve ser aumentado até 24 horas ao testar caldos de cultura contendo concentrações enzimáticas desconhecidas com substratos de CPH. Observe que os tempos de incubação apropriados dependem da atividade da(s) enzima(s), mas, em geral, se não houver atividade detectável dentro de 24 horas, é provável que a enzima não degrade o substrato testado. Uma enzima ativa está degradando os polissacarídeos cromogênicos insolúveis do substrato CPH em oligossacarídeos cromogênicos solúveis, que são visíveis como sobrenadantes coloridos.
- Coloque a placa do produto limpo dentro do coletor de vácuo com o bloco espaçador dentro.
- Coloque a placa do kit de ensaio por cima e aplique um vácuo (pressão negativa máxima de -60 kPa). Também é possível usar uma centrífuga a 2.700 x g por 10 min.
NOTA: O filtrado contendo os oligossacarídeos coloridos como produto da reação está agora na placa do produto para análise posterior.
3. Detecção e quantificação
- Verifique se o volume de líquido em cada poço da placa do produto é aproximadamente o mesmo por inspeção visual.
- Ler a absorvância da placa de recolha a 595 nm para o xilano CPH azul utilizando um leitor de placas.
- Ao fazer a análise de dados, subtraia os valores de controle negativo somente tampão dos valores dos poços onde uma enzima foi adicionada. Calcular o valor médio e o erro-padrão das médias (SEM) dos alvéolos replicados.