1. Ensaio Cromogênico com Substratos ICB em um Formato de 96 Poços
- Reação enzimática
- Adicionar o tampão acetato de sódio a 150 μl 100 mM, pH 4,5 e 5 μl de solução de endoxilanase a 31 U/ml a cada alvéolo da placa do kit de ensaio contendo palha vermelha de ICB-trigo (concentração enzimática final no poço: 1 U/ml).
nota: As placas do kit de ensaio (placas filtrantes de 96 poços contendo substratos ICB) são fabricadas conforme descrito na literatura (ver Lista de Materiais). Os substratos ICB são estáveis em tampões com uma faixa de pH entre pH 3,0 e 10,0. Sempre inclua o tampão sozinho como controle negativo, as enzimas comerciais como controle positivo e use um número estatisticamente apropriado de réplicas.
- Não ative os substratos ICB como a placa de substrato CPH, mas remova o estabilizador lavando três vezes com 100 μl de água seguida de filtração a vácuo ou centrifugação.
- Coloque a placa do produto embaixo da placa do substrato para coletar qualquer vazamento potencial da placa do substrato durante a agitação.
- Incubar a reação a 25 °C agitando a 150 rpm por 2 hr.
nota: Uma enzima ativa está degradando os polissacarídeos cromogênicos insolúveis no substrato ICB em oligossacarídeos solúveis, que são visíveis como sobrenadantes coloridos. Os substratos ICB são estáveis até 90 °C. O tempo de incubação deve ser aumentado até 24 horas se forem utilizadas enzimas não purificadas, tais como caldos de cultura.
- Coloque a placa do produto dentro do coletor de vácuo com o bloco espaçador dentro.
- Coloque a placa do kit de ensaio em cima e aplique vácuo (pressão negativa máxima de -60 kPa) ou use uma centrífuga para filtrar o produto da placa do kit de ensaio para o poço da placa do produto.
nota: O filtrado contendo os oligossacarídeos coloridos como produto de reação está agora na placa de coleta para análise posterior.
2. Detecção e quantificação
- Verifique se o volume de líquido em cada poço da placa de coleta é aproximadamente o mesmo por inspeção visual.
- Ler a absorvância da placa de recolha a 517 nm para palha de trigo ICB vermelha utilizando um leitor de placas.
- Ao fazer a análise de dados - subtraia o buffer - apenas os valores de controle negativos dos valores dos poços onde uma enzima foi adicionada. Calcular o valor médio e o erro padrão de médias (SEM) dos poços replicados.
nota: No caso de triagem de enzimas desconhecidas, sugerimos fazer uma série de diluições para obter dados mais detalhados sobre a faixa dinâmica da atividade da enzima.
