1. Ensaio de citotoxicidade: configuração
- Prepare soluções de compostos de interesse nas concentrações desejadas no meio apropriado (sem soro ou 1, 2,5 ou 5% FBS RPMI-1640).
- Para medir a citotoxicidade de um único composto (por exemplo, para determinar doses efetivas), prepare compostos em concentração final 2x.
- Para medir a citotoxicidade de combinações de compostos, prepare compostos em concentração final de 4x.
- Prepare os controles somente de solvente misturando a mesma quantidade de solvente com o meio apropriado. Por exemplo, se testar compostos dissolvidos em DMSO e metanol, faça o controle somente de solvente para cada solvente.
- Colete as células da placa ou frasco de cultura em um tubo cônico de 15 mL.
- Transfira 10 μL de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e core com 10 μL de azul de tripano a 0,4%. Use um hemocitômetro para contar células viáveis e não viáveis para cada fonte celular.
- Células de pellets a 200 g por 5 min. Aspirar ou decantar sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em meio apropriado para o ensaio (sem soro ou 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) a uma densidade celular de 3 * 105 células / mL.
NOTA 1: A densidade celular de 3*105 células/mL fornece uma densidade de semeadura de 15.000 células/poço. A densidade de semeadura é um parâmetro importante e, idealmente, deve ser pré-definida antes do experimento. A densidade de semeadura deve levar em consideração 1) tamanho da célula – geralmente células maiores são semeadas em uma densidade mais baixa; 2) duração do tratamento – as células são normalmente semeadas em uma densidade mais baixa para experimentos que durarão mais e 3) taxa de divisão celular – as células com uma taxa de divisão mais alta são semeadas em uma densidade mais baixa. Exemplos específicos de densidades de semeadura otimizadas: células K562, maiores, duração de 24 h – 10.000 células/poço; Células MOLM-13, tamanho moderado, tratamento de 24 h – 15.000/poço; Células MOLM-13, tratamento de 48 h – 8.000/poço; pequenas células mononucleares saudáveis do sangue periférico (PBMCs), tratamento de 24 horas – 50.000/poço; células primárias de LMA, tratamento de 24 h – 15.000-20.000/poço.
NOTA 2: A presença de FBS no meio pode afetar a atividade dos compostos. A redução da concentração de FBS pode tornar os resultados do ensaio mais simples de interpretar, mas também reduz a precisão fisiológica.
- Semeie 50 μL de suspensão celular da etapa 1.5 em cada poço de uma placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal.
- Adicione compostos da seguinte forma:
- Para ensaios de composto único, adicione 50 μL de solução composta 2x em cada poço. Para alvéolos de controle de solventes, adicione 50 μL de meio de teste contendo o solvente na concentração 2x.
- Para ensaios combinados, adicione 25 μL de cada um dos compostos (4x soluções) em cada poço. Para poços de controle de composto único, adicione 25 μL de solução composta 4x e 25 μL de meio de teste. Para poços de controle de solvente, adicione 50 μL de meio de teste ou meio de teste contendo o solvente.
NOTA 1: A concentração final de DMSO não deve exceder 0,5%.
NOTA 2: Recomenda-se adicionar o meio contendo os compostos com a pipeta tocando a parede de cada poço devido ao baixo volume.
- Bata suavemente na placa para garantir a mistura do conteúdo dos poços.
- Incubar as placas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO5 2 por um tempo apropriado, por exemplo, 24 h.
2. Ensaio de citotoxicidade: coloração com Hoechst 33342 e iodeto de propídio
- Prepare a solução de coloração 10x. Esta solução precisa ser preparada fresca antes de cada experimento, não pode ser armazenada. As concentrações finais do corante devem ser determinadas antes do experimento.
- Para linhagens celulares de leucemia e células de leucemia primária, 1 mL de tampão de coloração 10x contém 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 e 50 μL de iodeto de propídio 1 mg / mL em PBS estéril (concentrações finais: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg / mL).
- Para PBMCs saudáveis, 1 mL de tampão de coloração 10x contém 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 e 10 μL de iodeto de propídio 1 mg/mL em PBS estéril (concentrações finais: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
nota: A concentração final de iodeto de propídio deve ser determinada antes das experiências. As células devem ser testadas usando uma faixa de concentrações de PI (1, 2,5, 5 μg / mL) e, em seguida, a viabilidade calculada por Hoechst / IP deve ser comparada com a viabilidade medida por meio de azul de tripano. As concentrações de IP listadas acima foram escolhidas com base na viabilidade da célula-alvo em poços de controle de meio (acima de ~90% para linhagens celulares de leucemia, acima de ~70% para PBMCs saudáveis).
cuidado: Hoechst 33342 e iodeto de propídio são potenciais cancerígenos. Use equipamento de proteção individual adequado ao manuseá-los.
- Após a incubação, use uma pipeta multicanal para adicionar 10 μL de tampão de coloração 10x a cada poço.
nota: Para evitar contaminação cruzada, certifique-se de que as pontas da pipeta não toquem no meio.
- Bata suavemente no prato para misturar e limpar as bolhas. Manchar a 37 °C durante 15 min.
- Centrifugue a placa a 200 g durante 4 min para trazer todas as células para o fundo da placa. Limpe cuidadosamente a parte inferior da placa com um kimwipe úmido para remover fibras e/ou detritos que interferirão na geração de imagens.
NOTA 1: A centrifugação da placa garante as maiores chances de todas as células serem capturadas na imagem. Freqüentemente, as células mortas se desprendem e flutuam, fornecendo valores enganosos de citotoxicidade. A centrifugação atenua esse efeito.
NOTA 2: A placa deve ser visualizada o mais rápido possível após a centrifugação, idealmente, dentro de 15 min. A centrifugação pode reduzir a seletividade da coloração de IP e pode permitir que as células acumulem iodeto de propídio lentamente. A melhoria na precisão obtida com a visualização das células mortas supera o ligeiro aumento na coloração de IP
