Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento de eritrócitos do sangue total
- Adicionar 500 μL de sangue total em citrato ácido dextrose (ACD) (armazenado a 4 °C) a um tubo de microcentrífuga.
nota: O sangue total foi comprado na ACD. De acordo com a empresa, 1,5 mL de ACD é adicionado a 7 mL de sangue total (8,5 mL de volume total).
- Centrifugue todo o sangue a 700 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) e remova o plasma claro e a fina camada leucocitária usando uma pipeta para deixar a camada eritrocitária vermelha.
- Prepare 1 L de solução de Ringer contendo 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 32 mM de HEPES, 5 mM de glicose e 1 mM de CaCl2. Ajuste o pH para 7,4 adicionando gotas de 2 μL de NaOH 1,0 M. Para preparar uma solução de Ringer sem glicose, siga o mesmo protocolo, mas não inclua glicose na solução.
- Lave os eritrócitos 2x em solução de Ringer suspendendo o pellet celular em 1,5 mL de solução de Ringer, centrifugando a 700 x g por 5 min em RT e removendo o sobrenadante.
- Faça um hematócrito a 0,4% ressuspendendo 40 μL do pellet eritrocitário em 9.960 μL de solução de Ringer sem glicose para atingir um volume final de 10 mL.
nota: Hematócrito é um termo usado para se referir à fração de volume de eritrócitos em suspensão. Um hematócrito a 0,4% é uma suspensão contendo 0,4% de eritrócitos.
- Incubar a suspensão celular a 37 °C durante 7 dias.
2. Tratamento de eritrócitos com ionomicina e mensuração de hemólise
- Dissolva 1 mg de sal de ionomicina cálcico em 630 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) até atingir uma concentração final de 2 mM. Alíquota e conservar a -20 °C.
- Pegue 1 mL do hematócrito a 0,4% da etapa 1.5 e adicione 0,5 μL de ionomicina 2 mM para atingir uma concentração final de 1 μM. Incube por 2 h a 37 ° C.
- Use 1 mL do hematócrito sem tratamento com ionomicina como controle negativo.
- Centrifugue os hematócritos tratados com ionomicina e não tratados a 700 x g por 5 min em RT e remova seus sobrenadantes para deixar os grânulos celulares no fundo dos tubos.
- Lave as células 3x com solução de Ringer suspendendo os grânulos celulares em 1,5 mL de solução de Ringer, centrifugando a 700 x g por 5 min em RT e descartando os sobrenadantes.
- Para medir a hemólise, adicione 1 mL do hematócrito a 0,4% não tratado da etapa 1,5 a um tubo de microcentrífuga e incube por 2 h a 37 ° C como controle negativo para hemólise (0%).
- Adicione 1 mL do hematócrito a 0,4% não tratado da etapa 1,5 a um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 700 x g por 5 min em RT. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de água destilada ao pellet celular e incube por 2 h a 37 ° C como controle positivo para hemólise (100%).
- Adicione 1 mL do hematócrito a 0,4% tratado com ionomicina da etapa 2.2 a um tubo de microcentrífuga.
- Centrifugue as células não tratadas, as células tratadas e as células em água destilada a 700 x g por 5 min em RT.
- Pegue 200 μL dos sobrenadantes e adicione a uma placa de 96 poços.
- Medir a absorvância a 541 nm utilizando um leitor de microplacas.
- Calcule a hemólise usando a Equação 1:
%Hemólise = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
onde A0 é a absorbância dos eritrócitos em solução de Ringer, A100 é a absorbância dos eritrócitos em água e AT é a absorbância dos eritrócitos tratados pela ionomicina.
