Ensaio de ligação de anexina V: uma técnica baseada em fluorescência para identificar eritrócitos apoptóticos por meio da marcação de fosfatidilserina

Resumo

Fonte: Bigdelou, P., et al. Indução de Eriptose em Glóbulos Vermelhos Usando um Ionóforo de Cálcio. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de ligação da Anexina V para medir o grau de eriptose, morte celular programada por eritrócitos, usando coloração fluorescente com Anexina V. Os eritrócitos apoptóticos demonstram translocação de fosfatidilserina do folheto interno para o externo da membrana celular, fazendo com que a Anexina V marcada com fluoróforo se ligue à fosfatidilserina translocada, emitindo assim um sinal fluorescente.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Ensaio de ligação do anexo-V

1. Dissolva 1 mg de sal de ionomicina cálcico em 630 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) até atingir uma concentração final de 2 mM. Alíquota e conservar a -20 °C.
2. Pegue 1 mL do hematócrito a 0,4% e adicione 0,5 μL de ionomicina 2 mM para atingir uma concentração final de 1 μM. Incube por 2 h a 37 ° C.
3. Centrifugue os hematócritos tratados com ionomicina....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anexina V Alexa Fluor 488 - kit de apoptose	Fisher Científico	Rolamento A10788	Conservar a 4 °C
Citômetro de fluxo BD FACSAria II	BD Biociências	643177
Sal de cálcio ionomicina	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolva em DMSO até atingir 2 mM. Armazenar a -20 °C
centrifuga	Millipore Sigma	M7157	Modelo Eppendorf 5415C
Tubo de citometria de fluxo de fundo redondo descartável	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Científico	C79-500
DPBS	Soluções para ciências da vida da VWR	SH30028.02
Tubo de microcentrífuga	Fisher Científico	02-681-5
Sangue total na DAC	Zen-Bio		Conservar a 4 °C e aquecer a 37 °C antes de utilizar