Ensaio de ligação de anexina V: uma técnica baseada em fluorescência para identificar eritrócitos apoptóticos por meio da marcação de fosfatidilserina

Resumo

Fonte: Bigdelou, P., et al. Indução de Eriptose em Glóbulos Vermelhos Usando um Ionóforo de Cálcio. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de ligação da Anexina V para medir o grau de eriptose, morte celular programada por eritrócitos, usando coloração fluorescente com Anexina V. Os eritrócitos apoptóticos demonstram translocação de fosfatidilserina do folheto interno para o externo da membrana celular, fazendo com que a Anexina V marcada com fluoróforo se ligue à fosfatidilserina translocada, emitindo assim um sinal fluorescente.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Ensaio de ligação do anexo-V

1. Dissolva 1 mg de sal de ionomicina cálcico em 630 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) até atingir uma concentração final de 2 mM. Alíquota e conservar a -20 °C.
2. Pegue 1 mL do hematócrito a 0,4% e adicione 0,5 μL de ionomicina 2 mM para atingir uma concentração final de 1 μM. Incube por 2 h a 37 ° C.
3. Centrifugue os hematócritos tratados com ionomicina e não tratados a 700 x g por 5 min em RT e remova seus sobrenadantes para deixar os grânulos celulares no fundo dos tubos.
4. Lave as células 3x com solução de Ringer suspendendo os grânulos celulares em 1,5 mL de solução de Ringer, centrifugando a 700 x g por 5 min em RT e descartando os sobrenadantes.
5. Ressuspenda os grânulos de células eritrocitárias tratados e não tratados com ionomicina em 1 mL de tampão de ligação 1x.
6. Dilua 2 mL do tampão de ligação 5x anexina V em 8 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter 1x tampão de ligação.
7. Pegue 235 μL das suspensões celulares no tampão de ligação e adicione 15 μL de conjugado Annexin V-Alexa Flour 488.
8. Incube as células à temperatura ambiente (RT) por 20 min em local escuro. Centrifugar a 700 x g durante 5 min à RT e remover o sobrenadante.
9. Lave as células 2x com 1x tampão de ligação, suspendendo o pellet celular em 1,5 mL do tampão de ligação, centrifugando a 700 x g por 5 min em RT e removendo o sobrenadante.
10. Ressuspenda os grânulos celulares em 250 μL de tampão de ligação 1x para medições de citometria de fluxo.

2. Citometria de fluxo

1. Transferir 200 μL dos eritrócitos corados com anexina V para tubos de poliestireno de fundo redondo de 1 mL compatíveis com citometria de fluxo.
2. Faça login no software de citometria de fluxo e clique no botão novo experimento. Clique no botão do novo tubo. Selecione a planilha global e escolha a análise de aplicação para medir a intensidade de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
3. Defina o número de células para 20.000 a serem coletadas para análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
4. Selecione o tubo desejado e clique no botão de carga. Clique no botão de gravação para medições de dispersão direta e lateral. Repita para todas as amostras.
5. Clique com o botão direito do mouse no botão de amostra e clique em aplicar análise em lote para gerar o arquivo de resultados.
6. Clique com o botão direito do mouse no botão de amostra e clique em gerar arquivos FSC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anexina V Alexa Fluor 488 - kit de apoptose	Fisher Científico	Rolamento A10788	Conservar a 4 °C
Citômetro de fluxo BD FACSAria II	BD Biociências	643177
Sal de cálcio ionomicina	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolva em DMSO até atingir 2 mM. Armazenar a -20 °C
centrifuga	Millipore Sigma	M7157	Modelo Eppendorf 5415C
Tubo de citometria de fluxo de fundo redondo descartável	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Científico	C79-500
DPBS	Soluções para ciências da vida da VWR	SH30028.02
Tubo de microcentrífuga	Fisher Científico	02-681-5
Sangue total na DAC	Zen-Bio		Conservar a 4 °C e aquecer a 37 °C antes de utilizar