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NOTA: Como um ponto de referência conveniente para os leitores, a metodologia a seguir descreve as condições de cultura e materiais específicos necessários para a medição da biodisponibilidade de Fe de 20 amostras experimentais, além dos controles de qualidade necessários, em uma execução do bioensaio. Não é recomendado aumentar o número de amostras além dessa capacidade devido ao tempo necessário para várias etapas de cultura de células e digestão in vitro dentro do bioensaio.
1. Escolhendo a quantidade de amostras
- Para alimentos sólidos ou líquidos, determine uma quantidade de alimento que possa ser considerada representativa da amostra a ser testada.
- Ao testar a biodisponibilidade de Fe de uma variedade de feijão, use 100-150 g de semente de feijão e processe essa quantidade em uma amostra homogênea.
- Para amostras líquidas, como sucos fortificados, laticínios e bebidas esportivas, certifique-se de que os alimentos estejam bem misturados antes da amostragem.
NOTA: A quantidade de material de semente de feijão mencionada acima é essencial para explicar as diferenças inerentes entre as sementes desta cultura básica.
2. Preparação das amostras
- Enxágue a sujeira e a poeira de qualquer amostra de alimento com água destilada e deionizada antes do processamento.
- Processar a quantidade adequada de amostra de acordo com os objetivos experimentais, como por método de cozimento e moagem.
NOTA: Para cozinhar e processar, é fundamental usar panelas e equipamentos que não sejam uma fonte potencial de contaminante Fe. Equipamentos de aço inoxidável não contaminam; no entanto, equipamentos como moedores de moinho de pedra, panelas de ferro fundido e qualquer equipamento de aço não inoxidável contendo Fe podem adicionar quantidades significativas de contaminante Fe. Um moedor de café de aço inoxidável padrão geralmente é adequado para moer.
- Liofilizar e moer até obter um pó homogêneo.
NOTA: Uma vez homogeneizado, a pesquisa mostrou que três replicações independentes de análise são adequadas para cada alimento que está sendo medido.
- Se a homogeneidade da amostra for difícil de alcançar, revise a formulação ou processamento do produto. Se isso não for possível, adicione replicações se a não homogeneidade não for grave.
- Para a maioria dos alimentos sólidos homogêneos, use 0,5 g de amostra liofilizada por repetição. Se necessário, utilizar até 1,0 g de amostra por repetição, mas verificar se mais de 0,5 g produz um benefício no grau de resposta.
NOTA: Quantidades superiores a 0,5 g de alimentos sólidos podem obstruir a membrana de diálise (veja abaixo).
- Use 1-2 mL de amostras líquidas.
nota: A liofilização geralmente não é necessária para amostras líquidas.
3. Cultura de células Caco-2
- Culturas de estoque
- Adquira células Caco-2 de um fornecedor certificado.
- Cultive as células de frascos de estoque a 37 ° C em uma incubadora com uma atmosfera de ar de 5% de CO2 (umidade constante) usando o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com HEPES 25 mM (pH 7,2), soro fetal bovino (FBS) a 10% (v / v) e solução antibiótica-antimicótica a 1%.
- Uma vez que células suficientes estejam disponíveis, geralmente após 7 a 10 dias de cultura, semeie as células em frascos não revestidos de colágeno a uma densidade de 30.000 células/cm2.
- Escolha o tamanho do frasco dependendo do número de células disponíveis e necessárias para a semeadura de placas multipoços.
NOTA: Em geral, os frascos T225 (225 cm2) funcionam melhor para experimentos em que 11 placas multipoços (6 poços; 9,66 cm2 / poço) são usadas (10 placas para comparações de amostras, 1 placa para controles de qualidade) por bioensaio.
- Cultive células em frascos por 7 dias, trocando o meio a cada dois dias, e use no 7º dia para semear as placas multipoços.
NOTA: Recomenda-se usar um intervalo de passagem de não mais do que 10-15 passagens a partir de quando as células são iniciadas a partir da cultura de estoque e posteriormente usadas em uma série de experimentos. As passagens de cultura de células devem ser limitadas, pois uma ampla gama de passagens pode resultar em mudanças adaptativas na linha celular e, portanto, variabilidade na resposta do modelo.
- Cultura de células em placas multipoços
- Semeie as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células/cm2 em placas revestidas de colágeno de 6 poços.
NOTA: Esta etapa geralmente funciona melhor se for feita em uma quarta-feira. As etapas a seguir tornarão evidente por que este dia da semana é ideal.
- Cultive as células por 12 dias a 37 °C em uma incubadora com uma atmosfera de ar de 5% de CO2 (umidade constante) usando DMEM suplementado com HEPES 25 mM (pH 7,2), FBS a 10% (v/v) e solução antibiótico-antimicótica a 1%
NOTA: A cultura das monocamadas celulares por mais de 12 dias pode resultar em crescimento excessivo das células. Pesquisas anteriores mostraram claramente que, nessas condições, 12 dias após a semeadura, a monocamada celular está madura, bem presa à placa e ótima na consistência da resposta. O crescimento das células por mais tempo, como até 19-21 dias, resulta em crescimento excessivo de células, e o meio se esgota rapidamente em nutrientes, resultando em monocamadas prejudiciais à saúde.
- Durante o período de 12 dias, altere o meio pelo menos a cada 2 dias em uma programação diária consistente.
- No12º dia após a semeadura, substitua o meio de cultura por 2 mL de Meio Essencial Mínimo (MEM [pH 7]) suplementado com PIPES 10 mM (piperazina-N,N'-bis-[ácido 2-etanossulfônico]), solução antibiótico-antimicótica a 1%, hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selênio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fator de crescimento epidérmico (20 μg/L).
NOTA: Se a semeadura foi iniciada em uma quarta-feira, o 12º dia seria uma segunda-feira.
- No dia seguinte (ou seja, dia 13), remova o MEM e substitua-o por 1 mL de MEM (pH 7).
NOTA: Esta etapa ocorreria em uma terça-feira. Este é o dia em que o bioensaio começa; Assim, o cronograma de 13 dias oferece a vantagem de um cronograma semanal consistente, permitindo que o bioensaio seja realizado de forma consistente no mesmo dia da semana.
4. Digestão in vitro
- Preparação de anéis de inserção
- Crie um anel de inserção esterilizado usando um O-ring de silicone equipado com uma membrana de diálise lavada com ácido (Figura 1A).
NOTA: Prepare as bulas com 1 dia de antecedência (ou seja, segunda-feira, dia 12) do dia do bioensaio e armazene em água a 18 MΩ a 4 °C até a hora de usar.
- No dia do bioensaio (terça-feira, dia 13), retire as inserções da geladeira, escorra e substitua a água por HCl 0,5 M. Deixe-o em temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar por pelo menos 1 h antes do uso.
NOTA: Esta etapa deve ser feita antes de remover o MEM das placas de cultura. A lavagem ácida da membrana serve para remover possíveis contaminantes Fe e esteriliza o anel de inserção e a membrana.
- Drene o HCl 0,5 M das inserções e enxágue com água estéril a 18 MΩ. Armazene em água estéril de 18 MΩ em temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar até que esteja pronto para uso.
- Insira um anel em cada poço das placas de 6 poços com células Caco-2, criando assim um sistema de duas câmaras. Devolva as placas com os insertos para a incubadora.
NOTA: Esta etapa deve ser feita logo após a adição de 1,0 mL de MEM a cada poço (consulte a Etapa 3.2.5.).
- Preparação de solução de pepsina
- No dia do experimento, prepare a solução de pepsina dissolvendo 0,145 g de pepsina em 50 mL de HCl 0,1 M. Agite a solução suavemente em um agitador de plataforma por 30 min em temperatura ambiente.
- Preparação da solução de pancreatina-bile
- No mesmo dia do experimento, prepare 0,1 M de NaHCO3 dissolvendo 2,1 g de NaHCO3 em 250 mL de água a 18 MΩ.
- Misture 0,35 g de pancreatina e 2,1 g de extrato biliar em 175 mL de NaHCO0,1 M 3.
- Uma vez que a pancreatina e o extrato biliar estejam solubilizados, adicione 87,5 g de uma resina de troca catiônica fraca (consulte a Tabela de Materiais) e misture agitando por 30 min em temperatura ambiente.
- Despeje a pasta em uma coluna grande e colete o eluato.
- Eluir a coluna com mais 70 mL de NaHCO3 0,1 M, coletando esse volume na solução biliar da pancreatina.
NOTA: O objetivo da resina é remover o contaminante Fe comumente encontrado nos extratos biliares de pancreatina.
- Inicie a digestão in vitro.
- Pesar a amostra em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL (polipropileno), seguido pela adição de 10 mL de solução salina fisiológica a pH 2, contendo 140 mM de NaCl e 5 mM de KCl.
- Inicie o processo de digestão gástrica adicionando 0,5 mL da solução de pepsina suína preparada à amostra e incube em um agitador em temperatura baixa e suave por 1 h a 37 ° C.
- Após este período, inicie o processo de digestão intestinal de cada amostra ajustando o pH para 5,5-6,0 com 1,0 M NaHCO3.
- Adicione 2,5 mL da solução de pancreatina-bile a cada tubo de amostra e ajuste o pH para 6,9-7,0 com NaHCO3 1,0 M.
- Uma vez ajustado o pH, equalizar o volume em cada tubo usando solução de NaCl 140 mM, KCl 5 mM (pH 6,7), medindo o peso do tubo com um valor alvo de 15 g.
NOTA: Para alguns alimentos, pode ser necessário trazer o volume total para 16 g ou 17 g, dependendo da capacidade tampão dos alimentos.
- Transfira 1,5 mL de cada digestão intestinal para a câmara superior (ou seja, contendo o anel de inserção com a membrana de diálise) de um poço correspondente da placa de cultura de 6 poços contendo as células Caco-2 (Figura 1B).
- Recoloque a tampa da placa e incube a 37 ° C (5% CO2 atmosfera de ar) em um agitador de balanço a 6 oscilações/min por 2 h.
- Remova o anel de inserção com o digestor e adicione mais 1 mL de MEM (pH 7) a cada poço.
- Retorne a placa de cultura de células para a incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de ar CO2) por mais 22 h.
- Após 22 h, remova o meio de cultura celular e adicione 2,0 mL de água a 18 MΩ à monocamada celular.
NOTA: A água lisará osmoticamente as células.
- Colha todo o lisado celular em tubos de microcentrífuga de polipropileno padrão ou similares para análises subsequentes de proteína celular e ferritina celular.
