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NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.
1. Preparação de materiais
NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
- Prepare o meio 1, o meio de centrifugação 2 e as soluções de armazenamento e trabalho de 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) amino]-D-glicose fluorescente (2-NBDG ou FD-glicose) de acordo com a Tabela 1 em um gabinete de biossegurança Classe II. Proteja a FD-glicose da luz durante todo o experimento, desligando todas as luzes sob o capô.
- Use reagentes de cultura de células prontos para uso: tripsina-EDTA, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e meio Eagle modificado de Dulbecco sem glicose e sem vermelho de fenol (doravante, DMEM sem glicose).
- Use 20 mL de tampão de lise por ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA).
NOTA: Nas seções a seguir, a depleção extracelular e a captação intracelular de diferentes doses de FD-glicose são comparadas em fibroblastos 3T3-L1 com e sem estimulação com insulina (Figura 1).
2. Cultura e manutenção de células 3T3-L1
- Cultura de fibroblastos de camundongo 3T3-L1 por plaqueamento de 1 x 106 células diluídas em 20 mL de Meio 1 em duas placas de 96 poços. Placa de 100 μL de suspensão celular por poço, garantindo a manutenção da homogeneidade desta suspensão por mistura. Cultive células por 48 h em uma incubadora a 37 ° C (5% de CO2 e 95% de umidade) sem trocar de meio até cerca de 70% -80% de confluência.
- Mantenha as células confluentes e em jejum, cultivando-as no mesmo meio por 48 h. Varie o tempo de incubação de 24-72 h, dependendo do estado catabólico de jejum desejado.
3. Fome de células 3T3-L1
- Decantar meios das células nas placas de 96 poços. Absorva o fluido restante usando toalhas de papel estéreis.
- Enxágue a placa de 96 poços com 100 μL de PBS por poço e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis.
- Adicione 100 μL de DMEM livre de glicose por poço e incube por 40 min. Ajuste o tempo de incubação dependendo do tipo de célula, estímulos e nível desejado de jejum.
NOTA: O tempo de incubação pode exigir otimização dependendo da estação.
4. Preparação de soluções de FD-glucose com diferentes concentrações
NOTA: O experimento na Figura 1 examina meios extracelulares e intercelulares com e sem estimulação com insulina.
- Use oito repetições (uma fileira em uma placa de 96 poços) para cada condição de estimulação. Portanto, prepare 1 mL para cada condição de estimulação (especificada na Tabela 2 e abaixo).
- Use oito condições de estimulação sem insulina: FD-glicose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg/mL (controle sem FD-glicose) em uma placa de 96 poços.
- Use oito condições de estimulação com insulina (10 μg/mL, concentração final): FD-glicose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg/mL (controle sem FD-glicose) em outra placa de 96 poços.
- Para preparar as condições de estimulação, diluir 1 μL de 5 mg / mL de solução de trabalho de FD-glicose (Tabela 1) em 999 μL de DMEM livre de glicose para obter 1 mL de solução de estoque de trabalho (diluição 1: 1000 ou 5 μg / mL).
- Usando esta solução de estoque de trabalho, prepare diluições 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 e 1:100.000 de FD-glicose para obter 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,05 μg/mL (Tabela 2) em tubos de 2 mL imediatamente antes dos experimentos em uma cabine de biossegurança sem luzes.
- Repita a etapa 4.4 e adicione 1 μL de insulina (10 mg / mL, concentração final) a cada uma das condições especificadas acima.
NOTA: A concentração final de insulina nessas amostras é de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Para obter a homogeneização, adicione insulina aos tubos antes de adicionar outras soluções.
5. Tratamento de células 3T3-L1 famintas
- Após 40 min de incubação, decantar o DMEM sem glicose de cada poço em placas de 96 poços e absorver o fluido restante com toalhas de papel estéreis.
- Adicione 100 μL (por poço) de cada uma das várias condições de tratamento descritas acima aos poços ao longo de uma coluna e 100 μL (por poço) da mesma condição de tratamento aos poços ao longo da linha (oito repetições) em ambas as placas de 96 poços. Rotule as placas que utilizaram as condições com e sem insulina. Adicione DMEM livre de glicose sozinho aos poços de controle (n = 8).
- Incubar a placa durante 40 min numa incubadora de cultura de células (37 °C, 5% de CO2 e 95% de humidade) no escuro.
6. Medidas extracelulares e intercelulares para células 3T3-L1 estimuladas
- Após as células terem sido estimuladas por 40 min, transfira os meios de estimulação de ambas as placas para novas placas de 96 poços, mantendo o mesmo layout experimental.
- Transvase qualquer solução restante das placas originais estimuladas de 96 poços com células em toalhas de papel estéreis.
- Opcionalmente, lave as células com PBS. Remova o PBS e transvase qualquer solução restante em toalhas de papel estéreis.
- Adicione 100 μL do tampão de lise RIPA a cada poço. Opcionalmente, adicione inibidor de protease ao tampão RIPA para proteger as proteínas. Coloque as placas contendo RIPA em uma coqueteleira por 30 min.
- Usando um leitor de microplacas (Tabela de Materiais), meça a fluorescência nos comprimentos de onda de excitação (Ex) e emissão (Em) de 485 e 535 nm, respectivamente, primeiro no meio contendo FD-glicose extracelular e, em seguida, a placa com células lisadas por RIPA no final de 30 minutos de incubação (consulte a etapa 6.4).
Tabela 1: Preparação de meios de cultura e soluções de FD-glicose.
| Solução/Meio | Componentes |
| Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) | Etanol (200 μL) e DMSO (200 μL) em tubo de 1-1,5 mL; use etanol de grau de cultura celular e DMSO |
| Médio 1 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) e soro de bezerro (10%) (10 mL) em tubo estéril de 50 mL |
| Meio de centrifugação 2 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) e Soro Bovino (10%) (10 mL) em tubo estéril de 50 mL |
| Solução de glicose-FD de armazenamento 5 mg/mL (14,5 mM) | Glicose FD (1 mg) e etanol: DMSO (1:1/v/v) (200 μL) em tubo de 0,5 mL; armazenar a -80 °C, preferencialmente sob atmosfera de argônio ou nitrogênio |
| Solução de FD-glicose de trabalho 5 μg/mL (14,5 mM) | Solução de glicose FD de armazenamento 5 mg / mL (1 μL), DMEM livre de glicose (999 μL); prepare imediatamente antes do experimento. |
Tabela 2: Preparação de soluções de FD-glicose com diferentes concentrações para os experimentos mostrados na Figura 1.
| diluição | Controle | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentração (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| DMEM sem glicose (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glicose 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
